丹皮酚對(duì)人黑素瘤A375和M14細(xì)胞系增殖與凋亡的影響

陶 玥張孟麗馬鵬程?孫建方周武慶包 軍

丹皮酚對(duì)人黑素瘤A375和M14細(xì)胞系增殖與凋亡的影響

陶 玥1張孟麗2馬鵬程2?孫建方2周武慶2包 軍1

目的: 確定丹皮酚對(duì)體外培養(yǎng)人黑素瘤A375和M14細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法: 利用CCK8檢測(cè)黑素瘤A375和M 14細(xì)胞的增殖抑制率；以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化、Annexin－V/PI法觀察細(xì)胞凋亡的變化；用Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化。結(jié)果: 細(xì)胞周期顯示丹皮酚處理過的A375和M 14細(xì)胞G2/M期比例均高于對(duì)照組。以0 mmol/L、1.25mmol/L、2.5 mmol/L、5mmol/L丹皮酚作用24 h后，A375細(xì)胞的早期凋亡率分別為3.11%±0.53%，13.74%±1.73%，25.95%± 0.57%和46.44%±0.81%；M14細(xì)胞的早期凋亡率分別為1.00%±0.08%，2.00%±0.01%，2.99%±0.29%和14.73%±0.94%，呈劑量依賴性誘導(dǎo)A375和M14細(xì)胞凋亡。經(jīng)5 mmol/L丹皮酚作用后Hoechst33258染色示凋亡細(xì)胞形態(tài)改變。結(jié)論: 丹皮酚對(duì)黑素瘤A375和M14細(xì)胞均具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。

丹皮酚； 黑素瘤； A375； M 14； 凋亡

丹皮酚(TP)又稱牡丹酚，是分離自中藥牡丹及芍藥的干燥根皮和徐長(zhǎng)卿的根或全草中的一種小分子酚類化合物。研究證明丹皮酚有抗過敏與抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗微生物感染、抑制黑素合成等多種活性作用。1－4近年來丹皮酚的抗腫瘤作用也逐漸引起注意，現(xiàn)已證實(shí)其對(duì)食管癌、肝癌等多種腫瘤具有抗增殖、促凋亡的作用。5，6本研究以體外培養(yǎng)的人黑素瘤A375和M14細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，觀察丹皮酚對(duì)黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及誘導(dǎo)凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 丹皮酚購(gòu)自中國(guó)藥品生物檢定所(純度＞99.0%)；二甲基亞砜(DMSO)、1%抗生素/抗真菌溶液、Hoechst33258購(gòu)自Sigma公司，胰酶、1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自上海吉泰公司。CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Beckman Coulter公司，Annexin－V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Pharmingen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)A375、M14細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物配制 丹皮酚溶解于DMSO后稀釋于1640培養(yǎng)基，其終濃度分別為:0.5 mmol/L、1 mmol/ L、2 mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L；DMSO在培養(yǎng)基中的最大終濃度低于0.2%，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無影響。

1.2.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 分別將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375和M14細(xì)胞按1×104/孔分別接種于96孔板，在37℃及5%CO2下孵育24 h，去上清液，每孔加入含一定濃度丹皮酚(0.5，1，2，4，8 mmol/L)的1640培養(yǎng)基100μL，每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組直接加含有DMSO的1640培養(yǎng)基100μL，空白孔不加細(xì)胞，只加含有DMSO的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24，48和72 h后，吸出培養(yǎng)基，以1640培養(yǎng)基小心洗滌細(xì)胞2次，每孔加入100μL 1640培養(yǎng)基，再加入10μL CCK8溶液，在37℃及5%CO2下孵育2 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔吸光度值，細(xì)胞增殖抑制率＝[1－(待篩物各濃度平均吸光度值－空白組平均吸光度值)/(對(duì)照組平均吸光度值－空白組平均吸光度值)]×100%。

1.2.4 丹皮酚對(duì)細(xì)胞周期的影響 分別收集經(jīng)0，1.25，2.5，5 mmol/L丹皮酚作用24 h后的A375和M14細(xì)胞，吹打制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×106個(gè)細(xì)胞/mL，以PBS洗滌后制成100μL細(xì)胞懸液，加入100μL細(xì)胞裂解液渦旋7秒，再1 m L染液(碘化丙啶及RNA酶混合液)，室溫避光放置30 min，1 h內(nèi)以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5 丹皮酚細(xì)胞凋亡率的影響(乙硫氰酸熒光素(Annexin V)－FITC/碘化丙啶(PI)雙染法) 收集經(jīng)0，1.25，2.5，5 mmol/L丹皮酚作用24 h后的A375和M14細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌兩遍，以1×連接緩沖液將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/m L，每管加Annexin V－FITC 5μL、PI 5μL，輕輕震蕩混勻，室溫避光染色l5 min，每管加400μL 1×連接緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)將經(jīng)5mmol/L丹皮酚作用24 h后的A375和M14細(xì)胞以PBS洗滌后以4%多聚甲醛固定10 min，Hoechst33258(5μg/mL)避光染色20 min，棄去染液，甲醇漂洗1次，滴加甘油，以紫外光340 nm波長(zhǎng)激發(fā)，熒光顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。以只含DMSO的培養(yǎng)基處理過的A375和M14細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。

2 結(jié)果

2.1 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 與空白對(duì)照組比較，0.5，1，2，4，8mmol/L丹皮酚作用24，48，72 h均對(duì)A375和M14細(xì)胞有抑制作用，且與時(shí)間、濃度呈依賴關(guān)系。隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，丹皮酚對(duì)A375、M14細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸增高(圖1、2)。除作用A375細(xì)胞24 h的0.5mmol/L濃度組外，各組與對(duì)照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。丹皮酚處理A375細(xì)胞的24、48和72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別約為5.19 mmol/L，1.50 mmol/L和1.09 mmol/L，M14細(xì)胞24、48和72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別約為4.11 mmol/L，1.60 mmol/L和1.17 mmol/L。

圖1 丹皮酚對(duì)A375細(xì)胞增殖抑制率的影響(n＝3)

圖2 丹皮酚對(duì)M 14細(xì)胞增殖抑制率的影響(n＝3)

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 三種濃度(1.25，2.5，5 mmol/L)丹皮酚作用A375和M14細(xì)胞48 h后，G2/M期細(xì)胞百分比均較對(duì)照組升高，呈劑量依賴性(表1)。除1.25 mmol/L作用A375細(xì)胞組外，各組與對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。圖3、4為代表性的細(xì)胞周期流式結(jié)果圖。

表1 丹皮酚對(duì)A375、M14細(xì)胞G2/M期的影響

2.3 Annexin V－FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率見表2。丹皮酚對(duì)于黑素瘤細(xì)胞A375和M14均具有促凋亡作用，作用24 h后，隨著藥物濃度的升高(0，1.25，2.5，5 mmol/L)，A375和M14細(xì)胞的早期凋亡率均逐漸增高，各濃度丹皮酚組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。圖5、6分別為丹皮酚對(duì)A375及M14細(xì)胞凋亡率影響的流式結(jié)果圖。

2.4 Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) 熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組A375和M14細(xì)胞的Hoechst33258染色淡而均勻，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，較一致。而經(jīng)5mmol/L丹皮酚作用24 h的A375和M14細(xì)胞核染色加深呈強(qiáng)藍(lán)色熒光，形態(tài)不規(guī)則，大小不一，且伴有染色質(zhì)固縮、核碎裂等現(xiàn)象(圖7)。

表2 丹皮酚對(duì)A375和M14細(xì)胞凋亡的影響

圖3 丹皮酚對(duì)A375細(xì)胞周期影響的流式結(jié)果圖

圖4 丹皮酚對(duì)M14細(xì)胞周期影響的流式結(jié)果圖

圖5 丹皮酚對(duì)A375細(xì)胞凋亡率影響的流式結(jié)果圖

圖6 丹皮酚對(duì)M 14細(xì)胞凋亡率影響的流式結(jié)果圖

圖7 a，c分別為正常A375、M14細(xì)胞；b，d分別為5mmol/L丹皮酚作用24 h后的A375、M14細(xì)胞(Hoechst33258染色法，×400)

3 討論

皮膚黑素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)是一種高度惡性的皮膚腫瘤，該病早期極易發(fā)生血行及淋巴轉(zhuǎn)移，目前的治療方法以外科手術(shù)切除為主，藥物治療效果不理想，因此，尋求有效、低毒的抗腫瘤藥物一直受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的重視，而從植物中尋找活性化合物一直是其熱點(diǎn)。

丹皮酚藥理活性廣泛，臨床多用于心腦血管、炎癥、變態(tài)反應(yīng)及免疫系統(tǒng)等疾病。7近年來研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚還具有一定的抗腫瘤活性，能抑制多種腫瘤細(xì)胞如肝細(xì)胞癌、卵巢癌、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤等的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。6，8，9而針對(duì)黑素瘤這方面的研究尚未見報(bào)道。本研究即觀察多個(gè)濃度丹皮酚對(duì)黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、M14細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響，探討丹皮酚抗皮膚黑素瘤可能的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，丹皮酚能抑制皮膚黑素瘤A375、M14細(xì)胞的增殖活性，且這種作用隨著藥物濃度的升高和作用時(shí)間的增加而逐漸增強(qiáng)，具有濃度和時(shí)間依賴性。A375和M14細(xì)胞在丹皮酚作用24 h的IC50分別為5.19 mM和4.11 mM，提示作用24 h時(shí)，A375較M14對(duì)丹皮酚的抗增殖作用更為敏感。比較丹皮酚在食管癌、肝癌等腫瘤中的抑制增殖濃度較其在黑素瘤中的略低，即黑素瘤細(xì)胞對(duì)丹皮酚的抗增殖敏感度較消化道腫瘤低。5，6

流式檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果示:丹皮酚分別作用于A375、M14細(xì)胞24 h后，G2/M期細(xì)胞百分比均隨藥物濃度的增加而逐漸升高，而S期、G0/G1期則均未見規(guī)律性變化。細(xì)胞的G2/M期主要負(fù)責(zé)進(jìn)行細(xì)胞的有絲分裂，因此丹皮酚通過阻斷黑素瘤細(xì)胞在G2/ M期，阻滯細(xì)胞分裂，可能為其抑制黑素瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。此外，有研究顯示丹皮酚可阻滯肝癌HepG2細(xì)胞和食管癌SEG－1、ECA－109細(xì)胞在S期，5，6說明丹皮酚可將不同類型的腫瘤細(xì)胞阻斷在不同周期，其對(duì)細(xì)胞周期的作用具有細(xì)胞特異性。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示1.25，2.5，5 mmol/L丹皮酚作用于黑素瘤細(xì)胞24 h后，對(duì)A375和M14細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用具有濃度依賴性，A375細(xì)胞早期凋亡率分別為13.74%、25.95%、46.44%，M14細(xì)胞早期凋亡率分別為2.00%、2.99%、14.73%，與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究顯示丹皮酚在結(jié)直腸癌等細(xì)胞中的促凋亡濃度同為毫摩爾數(shù)量級(jí)，10說明該腫瘤與黑素瘤對(duì)丹皮酚抗凋亡的敏感性相當(dāng)。比較丹皮酚作用24 h后兩種細(xì)胞凋亡率的變化發(fā)現(xiàn)，A375細(xì)胞的凋亡率更高，提示作用24 h時(shí)，A375較M14對(duì)丹皮酚的誘導(dǎo)凋亡作用更為敏感。經(jīng)丹皮酚作用后的黑素瘤細(xì)胞株A375和M14細(xì)胞在染色后熒光顯微鏡下可觀察到出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變，也證實(shí)了凋亡的發(fā)生。

本研究結(jié)果證實(shí)，丹皮酚對(duì)人黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、M14具有抑制增殖和促凋亡的作用，荷瘤動(dòng)物試驗(yàn)其具體作用機(jī)制將在后續(xù)工作中進(jìn)一步探討。

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(收稿:2013－11－11 修回:2014－01－01)

Effects of paeonol on the proliferation and apoptosis in hum an m elanoma cell line A375 and M 14

TAO Yue，ZHANGMeng-li，MA Peng-cheng，et al.Department of Dermatology，Drum Tower Hospital，Nanjing，210042

Objective:To determine the effects of paeonol on the apoptosis and proliferation in humanmelanoma cell line A375 and M 14.Methods:The anti－proliferative activity of paeonol in A375 and M 14 cells was investigated by CCK8 assay.After A375 and M14 cells were treated by 1.25 mmol/L，2.5 mmol/L or 5 mmol/L paeonol for 24 h，flow cytometrywas used to detect the cell cycle and Annexin V－FITC and propidium iodide(PI)double staining was taken to detect the apoptosis rate of A375 and M14 cells，respectively. Themorphological changes of A375 and M14 cells treated by 5mmol/L paeonol for24 h were observed by Hoechest 33258 staining.Results:Compared with untreated A375 and M14 cells，an increase of cell population in G2/M phase was observed in paeonol－treated cells.After treatment of 0 mmol/L，1.25 mmol/L，2.5 mmol/L and 5 mmol/L paeonol for 24 h，the early apoptosis rate of A375 cellswas 3.11%±0.53%，13.74% ±1.73%，25.95%±0.57%and 46.44%±0.81%，respectively，while the rate of M14 cells was 1.00%± 0.08%，2.00%±0.01%，2.99%±0.29%and 14.73%±0.94%，in a dose－dependentmanner.After treated with paeonol of 5 mmol/L，there were morphological changes of apoptosis in A375 and M14 cells.Conclusion:Paeonol can inhibite proliferation and induce apoptosis of human melanoma cell line A375 and M14.

paeonol；melanoma；A375；M14；apoptosis

1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院皮膚科，南京，210008

2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，南京，210042

陶玥，張孟麗并列第一作者。

?通信作者