C-型鈉尿肽對大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響

劉虎子，史春麗，劉愛軍

多種心臟病均導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生，在心肌組織中，心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）是數(shù)量最多的一類細(xì)胞，心肌纖維化中的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）重構(gòu)過程中，CFs居于核心地位，發(fā)揮著最重要的作用［1，2］。鈉尿肽家族（natriuretic peptides）對心血管功能具有多方面的影響［3，4］。以往研究多集中在心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉尿肽（brain natriuretic peptide，BNP）上，而對于 C-型鈉尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）的研究還很不充分，有研究表明CNP對于心肌重構(gòu)中常伴隨發(fā)生的纖維化過程具有抑制作用［5，6］，而其具體機(jī)制目前尚不清楚。本研究采用體外培養(yǎng)的大鼠CFs，觀察CNP對其增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成分如Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響，從而在細(xì)胞水平方面探討CNP抑制心肌ECM重構(gòu)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自美國Promega公司；Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原小鼠單克隆一抗抗體購自美國Abcam公司；CNP購自美國Bachem公司，GAPDH小鼠單克隆一抗抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 選用1 d～3 d新生Sprague-Dawley大鼠（SPF級），于無菌條件下開胸取心室肌，用眼科剪碎塊后，置于0.08%胰蛋白酶中，于37℃消化并收集消化液，反復(fù)數(shù)次至消化完全后，將全部消化液離心，棄去上清，細(xì)胞沉淀加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液中，充分混懸后，接種于培養(yǎng)瓶中，差速貼壁法分離獲得CFs，分離得到的CFs進(jìn)行傳代，第2代～第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。達(dá)到70%～80%融合后的CFs，血清饑餓24h，使細(xì)胞同步化后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和給予不同濃度（10-9mol／L、10-8mol／L、10-7mol／L）的CNP處理組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。1.3 MTS法檢測 CFs達(dá)到70%～80%融合后，胰酶消化混懸細(xì)胞，以5×103個(gè)／孔的密度均勻接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜后，無血清DMEM饑餓24 h，使其同步化。分為空白對照組，余下各組加入不同濃度CNP，使其終濃度分別為10-9mol／L、10-8mol／L、10-7mol／L，同時(shí)設(shè)立調(diào)零組，其各孔內(nèi)無細(xì)胞，只加培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將每孔中的培養(yǎng)液吸棄，加入100μL新鮮DMEM培養(yǎng)液，然后再加入20 μL MTS顯色試劑，震蕩使其充分混勻，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h后，于酶標(biāo)儀570 nm處測定各孔吸光光度值，細(xì)胞增殖活力以調(diào)零后的測定組與對照組的吸光光度值之比來表示。

1.4 Western blot檢測 胰酶消化法收集各組細(xì)胞，棄上清，PBS洗3遍，加入細(xì)胞裂解液，于4℃裂解30 min后，4℃，12 000 r／min離心，收集上清，BCA法測定蛋白提取液的總蛋白濃度。含等量蛋白（60μg）的樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜，加Ⅰ型膠原一抗（1∶2 000）或Ⅲ型膠原一抗（1∶1 000），或GAPDH一抗（1∶5 000），4℃孵育過夜，洗膜，加 HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗（1∶10 000），室溫孵育1.5 h，洗膜，ECL法顯色并掃描記錄條帶，用Quantity One軟件測定分析各條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTS檢測結(jié)果 不同濃度的CNP處理CFs 24 h后，與對照組相比，吸光光度值（OD值）顯著下降（P＜0.05），并具有濃度依賴性。10-7mol／L CNP處理后，與對照組相比，OD值降為（75.8±14.1）%。提示CNP能夠顯著抑制CFs的增殖。詳見圖1。

圖1 CNP抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖

2.2 Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá) 不同濃度的CNP處理CFs 24 h后，與對照組相比，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05），并具有濃度依賴性。10-7mol／L CNP處理后，與對照組相比，Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量降為（70.3±18.5）%，Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)降為（75.6±19.3）%。詳見圖2。

圖2 CNP抑制心肌成纖維細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)

3 討 論

CFs是心肌組織中數(shù)量最多的細(xì)胞類型，約占70%，多種心臟疾病，如高血壓、心肌梗死、風(fēng)濕性心臟病等情況下，往往導(dǎo)致包括心肌纖維化在內(nèi)的心肌重構(gòu)的發(fā)生，心肌纖維化包括CFs數(shù)量上的異常增多及心肌ECM成分代謝的失衡。CFs自身的增殖和對ECM成分如Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)的調(diào)控，對于心肌纖維化有著極為重要的意義，也是ECM重構(gòu)的主要方面。盡管在初期，CFs生物學(xué)功能的改變有益于心肌組織的修復(fù)并利于心功能的維持，但在病理因素的持續(xù)刺激下，隨著纖維化程度的不斷加重，其長期效應(yīng)則導(dǎo)致心肌僵硬度的持續(xù)增高，并最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生［1，2］。

鈉尿肽家族主要包括ANP、BNP、CNP等，已有研究表明這些多肽能調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)多方面的功能。以往較多的關(guān)注均集中于ANP和BNP，研究發(fā)現(xiàn)其主要由心肌細(xì)胞分泌，在多種心臟病心肌組織中表達(dá)升高，并對CFs及心肌細(xì)胞的增殖、肥大等生物學(xué)功能具有抑制作用［3，4］。CNP是由22個(gè)氨基酸組成的多肽，最初是在豬腦提取物中分離發(fā)現(xiàn)的，以往研究表明其對于血管損傷后內(nèi)膜的形成具有抑制作用［7］。在心血管疾病領(lǐng)域，有研究報(bào)道CNP表達(dá)上調(diào)與動脈粥樣硬化及再狹窄病變的發(fā)生有關(guān)［8，9］。最近研究發(fā)現(xiàn)，心肌組織也是CNP的重要合成部位，其表達(dá)在慢性心力衰竭病人心肌組織中升高［10］。CNP主要通過旁分泌和自分泌作用影響心血管系統(tǒng)功能，在心肌組織中，CFs是CNP的重要來源細(xì)胞［5］。動物實(shí)驗(yàn)表明，CNP對心肌纖維化具有抑制作用，這可能是由其對細(xì)胞內(nèi)cGMP／PKG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活作用所致［6］。而CNP對CFs生物學(xué)功能及ECM蛋白表達(dá)的影響如何，目前尚不完全清楚。本研究結(jié)果表明，CNP能顯著抑制大鼠CFs的增殖，并能下調(diào)Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白在CFs中的表達(dá)，這可能是其抑制心肌ECM重構(gòu)的重要機(jī)制。在心血管病治療領(lǐng)域，CNP因其顯著的抗心肌纖維化作用，有望在將來用于抑制心肌重構(gòu)的臨床治療之中。

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