新鄉(xiāng)地區(qū)漢族人群尋常型銀屑病與HLA－DRB1?07等位基因的關(guān)聯(lián)研究

朱明明張玉毅劉鳳艷

新鄉(xiāng)地區(qū)漢族人群尋常型銀屑病與HLA－DRB1?07等位基因的關(guān)聯(lián)研究

朱明明1張玉毅2劉鳳艷1

目的: 確定新鄉(xiāng)地區(qū)漢族人群尋常型銀屑病與HLA－DRB1?07等位基因的相關(guān)性。方法:采用聚合酶鏈反應(yīng)－序列特異性引物(PCR－SSP)法檢測(cè)新鄉(xiāng)地區(qū)200例漢族尋常型銀屑病患者和200名健康對(duì)照者的HLA－DRB1?07等位基因頻率。結(jié)果: 病例組HLA－DRB1?07等位基因頻率(57.5%)高于對(duì)照組(27.5%)；發(fā)病年齡≤40歲患者等位基因頻率(60.47%)高于＞40歲患者(39.29%)。結(jié)論: HLA－DRB1?07等位基因可能與新鄉(xiāng)地區(qū)漢族人銀屑病相關(guān)，尤其是早發(fā)型銀屑病。

尋常型銀屑病； HLA－DRB1?07等位基因； 聚合酶鏈反應(yīng)－序列特異性引物

銀屑病是一種炎癥性角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖性皮膚病，其發(fā)病率隨地理位置不同而不同。在歐洲一些地區(qū)和美國(guó)，發(fā)病率可達(dá)2%～3%，而在日本發(fā)病率不到0.1%，據(jù)調(diào)查我國(guó)人群的患病率約為0.123%。1遺傳因素在尋常型銀屑病的發(fā)病中起相當(dāng)重要的作用，如HLA(人類白細(xì)胞抗原)被認(rèn)為是銀屑病最重要的遺傳學(xué)標(biāo)志之一。HLA基因的多態(tài)性與銀屑病的遺傳易感性明顯相關(guān)且HLA基因的連鎖不平衡性是形成HLA基因與銀屑病相關(guān)的基礎(chǔ)，各國(guó)學(xué)者在對(duì)不同民族銀屑病患者的研究中，已發(fā)現(xiàn)一些HLA等位基因與尋常型銀屑病(PV)相關(guān)。迄今為止，還沒(méi)有關(guān)于HLA－DRB1?07等位基因與河南新鄉(xiāng)地區(qū)漢族PV的相關(guān)研究報(bào)告。本文對(duì)河南新鄉(xiāng)地區(qū)漢族PV與HLA－DRB1?07等位基因相關(guān)性進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 銀屑病患者共200例，其中男103例，女97例；年齡3～74歲，平均25歲；≤40歲172例，＞40歲28例；根據(jù)銀屑病患者I級(jí)或II級(jí)親屬有無(wú)患銀屑病可將其分為有家族史患者和無(wú)家族史患者兩組，有陽(yáng)性家族史的11例，≤40歲且有陽(yáng)性家族史的10例。所有患者均為新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院確診的漢族銀屑病患者，彼此之間無(wú)任何親緣關(guān)系，且不伴有其他皮膚疾病的表現(xiàn)。200名健康對(duì)照為新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院明確的漢族人，其中男107名，女93名；年齡4～77歲，平均28.6歲。兩組受試者均為漢族血系，2代以上生活在河南新鄉(xiāng)地區(qū)的漢族人。

1.2 基因組DNA的制備 使用酚－氯仿法提取DNA。(1)凍存的EDTA抗凝血在室溫融化后，取500μL于離心管，加入等體積TE(pH 8.0)，混勻，4℃，10000 r/min離心10 min，棄上清；(2)加入180 μL TE、20μLSDS(10%)、8μL蛋白酶K(10mg/mL)混勻，置于37℃水浴過(guò)夜；(3)從水浴中取出樣品，輕微離心沉淀樣本。在反應(yīng)管中加入等體積的Tris飽和酚(約300μL)，充分混勻，室溫下10000 r/min離心10min，吸取上清液(約300μL)至一新離心管中。重復(fù)酚抽提1次，吸取上清液至一新離心管中；(4)加入等體積的Tris飽和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150 μL)，混勻，室溫10000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管；(5)加入1/20～1/10體積3 mol/L，pH 5.0醋酸鈉(約30μL)，2倍體積預(yù)冷100%乙醇，輕輕混合，可見(jiàn)白色絮狀沉淀。室溫10000 r/min離心10 min，使DNA沉淀于管底，棄上清；(6)向DNA沉淀加入70%乙醇，漂洗1次，室溫7000 r/min離心5 min，棄上清，置于室溫中揮發(fā)剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH 8.0)4℃過(guò)夜溶解DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 針對(duì)HLA－DRBl?07等位基因，特異性引物按照參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)。2上游引物序列: 5'－CCTGTGGCAGGGTAAGTATA－3'；下游引物序列: 5'－CCCGTAGTGTCTGCTCAC－3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)為232 bp。PCR反應(yīng)在梯度PCR儀上進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)25μL體系10×PCR Buffer 2.5μL，Mg2＋2.5μL，P－1 1μL，P－2 1μL，Taq酶0.6μL，dNTP 3μL，滅菌雙蒸水9.4 μL，DNA模板5μL。反應(yīng)體系:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，最后延伸10 min，共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物10μL加2μL載樣緩沖液，1.5%瓊脂糖凝膠電泳(電壓為100 V，約50 min)，紫外分析儀觀察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)對(duì)患者組及對(duì)照組的HLA－DRB1?07等位基因頻率進(jìn)行比較，計(jì)算P值。同時(shí)計(jì)算相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值(OR)，OR＝(攜帶基因的患者數(shù)×不攜帶基因的對(duì)照組人數(shù))/(攜帶基因的對(duì)照組人數(shù)×不攜帶基因的患者數(shù))。

2 結(jié)果

2.1 HLA－DRB1?07等位基因PCR結(jié)果 見(jiàn)圖1。

圖1 HLA－DRB1?07等位基因PCR結(jié)果

2.2 PV患者與健康對(duì)照者HLA－DRB1?07等位基因頻率的比較 見(jiàn)表1。

銀屑病患者與健康對(duì)照者HLA－DRB1?07等位基因頻率比較，差異有顯著性意義(χ2＝33.379，P＝0.000)，銀屑病患者HLA－DRB1?07暴露率是健康對(duì)照者的4.284倍，(OR＝4.284，95%可信區(qū)間2.790～6.578)

表1 銀屑病患者與健康對(duì)照者HLA－DRB1?07等位基因頻率比較

2.3 ≤40歲與＞40歲銀屑病患者之間HLA－DRB1?07等位基因分布頻率比較 見(jiàn)表2。

表2 銀屑病患者≤40歲與＞40歲之間HLA－DRB1?07等位基因頻率比較

HLA－DRB1?07等位基因在≤40歲和＞40歲銀屑病患者之間的分布差異有顯著性意義(χ2＝4.420，P＝0.036)。

2.4 有家族史及無(wú)家族史銀屑病患者HLA－DRB1?07等位基因分布頻率比較 見(jiàn)表3。

表3 銀屑病患者有無(wú)家族史HLA－DRB1?07等位基因頻率比較

有家族史及無(wú)家族史銀屑病患者HLA－DRB1?07等位基因分布頻率比較，差異無(wú)顯著性意義(χ2＝2.128，P＝0.145)。

3 討論

對(duì)于HLA－DRB1?07等位基因與銀屑病之間的相關(guān)性研究已經(jīng)在很多地區(qū)和國(guó)家有相關(guān)的報(bào)道，Grubic等3報(bào)道HLA－DRB1?07等位基因與克羅地亞人I型銀屑病相關(guān)。Schmitt－Egenolf等4也發(fā)現(xiàn)HLA－DRB1?0701/02與I型尋常型銀屑病顯著相關(guān)。張慶瑞等5通過(guò)PCR/SSP方法對(duì)遼寧地區(qū)尋常型銀屑病患者進(jìn)行HLA－DRB1檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀屑病患者組HLA－DRB1?0701等位基因頻率比對(duì)照組明顯增高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示病例組HLA－DRB1?07等位基因頻率顯著升高，兩者呈較強(qiáng)關(guān)聯(lián)。本研究還發(fā)現(xiàn)≤40歲患者該等位基因頻率顯著高于＞40歲患者，提示HLA－DRB1?07與早發(fā)型銀屑病(發(fā)病年齡≤40歲)更為相關(guān)。遺傳流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，銀屑病的發(fā)病具有一定的家族傾向性，本研究表明，有無(wú)家族史銀屑病患者HLA－DRB1?07等位基因分布頻率比較，無(wú)顯著性差異。

1全國(guó)銀屑病流行調(diào)查組.全國(guó)1984年銀屑病流行調(diào)查報(bào)告.中華皮膚科雜志，1986，19(3):253－261.

2Olerup 0，Zetterquist H.HLA－DR typing by PCR amplification with sequence－specific primers(PCR－SSP)in 2 hours:an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor recipientmatching in eadaverie transplantation.Tissue Antigens，1992，39(3):225－235.

3Grubic Z，Zunee R，Kastelan M，eta1.HLA class IIhaplotypie association and DQCARmierosatellite polymorphisms in Croatian patientswith psoriasis.Coil Antropol，2002，26(1):61－67.

4 Schmit－Egenolf M，Eirmann TH，BoehnkeWH，et a1.Familial juvenile onset psoriasis is associated with the human leukocyte antigen(HLA)class Iside of the extended haplotype CW6－B51－DRBl?0701－DQAl－0201－DQBl?0303:a population and family based study.J Invest Dermatol，1996，106(4):711－714.

5張慶瑞，馮輝，翟寧，等.中國(guó)北方尋常型銀屑病與HLADRB1基因關(guān)聯(lián)的研究.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，1999，16(3): 146－147.

(收稿:2013－11－21 修回:2014－05－29)

Association between HLA－DRB1?07 allele and psoriasis vulgar in Xinxiang Chinese

ZHU Ming-ming，ZHANGYu-yi，LIU Feng-yan.The Third Affiliated Hospital ofXinxiang Medical University，Henan，453003

Objective:To determine the association between HLA－DRB1?07 allele and psoriasis vulgar (PV)in Chinese population of Xinxiang.Methods:Allelic frequency of HLA－DRB1?07 in 200 patients with PV and 200 healthy controlswere detected by PCR－SSP.Results:HLA－DRB1?07 allelic frequency in patients(57.5%)were higher than that in controls(27.5%).HLA－DRB1?07 allelic frequency in patients aged≤40 yrs at onset of the disease was60.47%which was higher than that in patients aged＞40 yrs at onset of the disease(39.29%).Conclusion:HLA－DRB1?07may be associated with PV in Han Chinese population of Xinxiang，especially in the patientswith early－onset psoriasis.

psoriasis vulgar；HLA－DRB1?07 allele；PCR－SSP

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)，453003

2湖北省襄樊市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北襄樊，441000