飼料中添加α－酮戊二酸對草魚熱休克蛋白70和過氧化物酶體增殖物激活受體γmRNA表達的影響

梁 健 趙玉蓉 王紅權 金柏濤 唐德約 伍 琴

近年來，由于水環(huán)境的惡化和病害的頻發(fā)，嚴重影響草魚的健康養(yǎng)殖，因此尋找綠色環(huán)保的免疫增強劑已成為當前水產(chǎn)動物營養(yǎng)的研究熱點。谷氨酰胺(glutaminate，Gln)是近年來研究較多的營養(yǎng)素，它是動物體內含量最多的氨基酸，是腸黏膜細胞、淋巴細胞等快速生長的主要能源，已作為免疫增強劑在鯉魚的試驗中取得了很好的效果［1］。但是Gln不耐熱，對酸敏感，在水中溶解度低，且在溶液中易環(huán)化成有毒性的焦谷氨酸［2］。α－酮戊二酸(α-ketoglutarate，AKG)具有 Gln 碳架，是三羧酸循環(huán)的中心物質，它通過谷氨酸脫氫酶或轉氨酶作用生成谷氨酸，并能進一步通過谷氨酰胺合成酶迅速形成Gln［3］。AKG既是Gln的前體物，又有無毒穩(wěn)定的特點，因此它可能成為Gln的最佳替代物。研究表明，AKG能促進機體蛋白質的合成，增強機體免疫力，防止疾病感染，可作為飼料添加劑來減輕畜禽動物生產(chǎn)過程中的代謝應激［4－5］。位瑩瑩等［6］研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的AKG可以在一定程度上提高松浦鏡鯉的增重率和蛋白質效率，降低飼料系數(shù)，促進魚體蛋白質和脂肪代謝。

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是細胞受到各種刺激時產(chǎn)生的一類具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質分子家族，普遍存在于原核和真核生物細胞中［7］。研究表明，熱休克蛋白70(HSP70)具有多項功能，主要包括協(xié)助新生蛋白質的折疊，參與細胞內蛋白質的轉運，參與免疫復合物的形成和分解，降解冗余蛋白質。在醫(yī)學上，HSP70具有排斥和治療傳染病，促進免疫反應的作用［8－12］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxi someproliferator activated receptor gama，PPARγ)是一類能被內源性脂肪酸以及外源性過氧化物酶體增殖物作為配體激活的核轉錄因子，可通過與配體結合、活化，調節(jié)脂肪代謝，改善胰島素抵抗，調節(jié)炎癥、免疫以及細胞分化等［13－15］。研究表明，Gln能提高人肺巨噬細胞和上皮細胞HSP70和熱休克蛋白72(HSP72)mRNA的表達，從而抵抗膿毒的損傷作用［16－17］;能通過調節(jié)仔豬PPARγmRNA的表達緩解斷奶應激產(chǎn)生的炎癥［18］。但 AKG 能 否 通 過 調 控 HSP70、PPARγ mRNA的表達來提高草魚抗應激和免疫能力尚未見報道。本試驗擬采用實時熒光定量PCR方法檢測飼料中添加不同濃度的AKG后HSP70和PPARγmRNA在草魚不同組織的表達及其規(guī)律，以期為AKG作為魚類抗應激飼料添加劑和免疫增強劑的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

根據(jù)《草魚配合飼料營養(yǎng)標準》(SC/T 1024—1997)配制基礎飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗飼料所用AKG購自上海海曲化工有限公司，純度為 99%，參照虹鱒稚魚［19］、全雄奧尼羅非魚［20］中 Gln 的添加標準，按質量分數(shù) 0.25%、0.50%、0.75%、1.00%分別等量替換基礎飼料中的次粉。所有飼料原料先粉碎至全部通過0.425 mm的篩，微量成分采取逐級擴大法混合均勻后，所有飼料原料經(jīng)充分混合，然后經(jīng)SLX－80型顆粒飼料機制成直徑為2.5 mm的顆粒料，自然風干后置于－20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗用草魚購于湖南省水產(chǎn)科學研究所，為同批魚種。選取平均體重為(35.66±0.39)g的健康草魚450尾，隨機分為5組(每組3個重復，每個重復30尾魚):對照組飼喂基礎飼料，試驗組分別飼喂添加 0.25%、0.50%、0.75%、1.00%AGK 的試驗飼料。

養(yǎng)殖試驗在湖南農業(yè)大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地室外養(yǎng)殖池塘進行。試驗前，將所有試驗魚集中馴養(yǎng)10 d，使其適應試驗環(huán)境和試驗飼料。試驗開始時將魚稱重分組，并調整至各組間初始體重差異不顯著(P＞0.05)。試驗魚以重復為單位飼養(yǎng)于1 m×1 m×1 m的網(wǎng)箱中，為期60 d。分別于每天08:00和16:00進行投喂，日投喂量為魚體重的2%～4%，觀察并記錄試驗魚的攝食及活動狀況。試驗期間，水溫為 28～32 ℃，pH 為 6.7～7.2，溶氧濃度在5.0 mg/L以上。不定期對網(wǎng)箱進行清洗，盡量排除外界因素對試驗結果的干擾。

1.3 樣品采集和指標測定

飼養(yǎng)試驗結束后，停食24 h，以網(wǎng)箱為單位稱重，然后每箱隨機取接近平均體重的魚3尾，丁香油麻醉，用滅菌的解剖工具分別取第3鰓弓、肝胰臟、腎臟、脾臟，液氮中速凍，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因表達分析

1.4.1 引物設計及合成

參照陳亮等［21］的方法，以 β－肌動蛋白(β-actin)mRNA序列作為內參基因，根據(jù) NCBI中草魚的HSP70、PPARγ基因序列登錄號(分別為GU475146、GU997136)，用 Primer 5.0 軟件設計引物(表2)。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表2 HSP70、PPARγ和β-actin的引物設計Table 2 Primer design for HSP70，PPARγ andβ-actin

1.4.2 總RNA的提取和反轉錄

用天恩澤動物組織提取試劑盒進行總RNA的提取，所有過程均在無菌操作臺上嚴格按照操作說明書進行。采用核酸蛋白質測定儀分別于260和280 nm處檢測提取的總RNA的濃度和純度。cDNA合成按照ReverAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit操作說明書進行，反應結束后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR采用SYBR GreenⅠ染料法，按照SYBR Premix EX TaqTM(TaKaRa公司)操作說明書在ABI 7300實時熒光定量PCR儀上進行擴增。20μL反應體系為:cDNA 2μL，上、下游引物各 0.8 μL，ddH2O 5.8 μL，SYBR Premix EX TaqTM10 μL，ROX Reference 0.6 μL。反應條件為:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，61℃ 31 s，共40個循環(huán)。PCR擴增完成后用熔解曲線分析法確定產(chǎn)物特異性。

1.4.4 擴增效率的檢測

所有樣品的cDNA各取1μL混勻后，進行10倍系列稀釋，選取6個稀釋度進行實時熒光定量PCR擴增反應，每個稀釋度設3個重復，根據(jù)6個稀釋系列實時熒光定量PCR反應結果，以循環(huán)閾(threshold cycle，Ct)值為縱坐標，以稀釋倍數(shù)值為橫坐標，獲得相對定量標準曲線。β-actin、HSP70和PPARγ的標準曲線分別為 Y=－3.182 6X+14.944、Y= －3.191 8X+30.881 和 Y= －3.217 5X+15.632，相 關 系 數(shù) 分 別 為 0.991 5、0.992 3 和0.994 5，根據(jù)公式擴增效率 =10(－1/斜率)－1 計算出三者的擴增效率分別為1.061 5、1.057 3 和 1.045 5，符合實時熒光定量PCR中雙Ct法對擴增效率的要求［22］。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用公式 2－(△△Ct)［22］計算各基因 mRNA 的相對表達量，試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003初步整理后，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，并用Duncan氏法進行多重比較，試驗結果用平均值±標準差表示，以 P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 HSP70、PPARγ mRNA 在對照組草魚不同組織中的表達

統(tǒng)計分析結果(圖 1、圖 2)表明，HSP70、PPARγmRNA在對照組草魚的肝胰臟、腎臟、鰓和脾臟中均有表達，且在各組織間的相對表達量存在差異。二者均在腎臟中高度表達，且在腎臟中的相對表達量顯著高于脾臟、鰓中(P＜0.05)。HSP70 mRNA的相對表達量在腎臟、肝胰臟、脾臟、鰓中依次降低，而PPARγmRNA的相對表達量在腎臟、肝胰臟、鰓、脾臟中依次降低。

圖1 HSP70 mRNA在不同組織中的相對表達量Fig.1 Relative expression level of HSP70 mRNA in different tissues

圖2 PPARγmRNA在不同組織中的相對表達量Fig.2 Relative expression level of PPARγmRNA in different tissues

2.2 飼料中添加 AKG對草魚 HSP70 mRNA相對表達量的影響

統(tǒng)計分析結果(表3)表明，飼料中添加AKG極顯著影響HSP70 mRNA在草魚鰓和脾臟中的表達(P＜0.01)，顯著影響HSP70 mRNA在草魚腎臟中的表達(P＜0.05)，而對HSP70 mRNA在草魚肝胰臟中的表達無顯著影響(P＞0.05)。與對照組相比，0.25%、0.50%和 0.75%AKG 組鰓中 HSP70 mRNA的相對表達量雖有所增加，但差異不顯著(P＞0.05)，而 1.00%AKG 組鰓中 HSP70 mRNA的相對表達量則極顯著增加(P＜0.01);飼料中添加AKG顯著降低了HSP70 mRNA在腎臟中的相對表達量(P＜0.05)，但各 AKG添加組間差異不顯著(P＞0.05);隨著飼料中AKG添加量的增加，HSP70 mRNA在脾臟中的相對表達量規(guī)律性不明顯，但0.75%AKG組脾臟中 HSP70 mRNA的相對表達量最高，并極顯著高于其他各組(P＜0.01)。

2.3 飼料中添加 AKG對草魚 PPARγmRNA相對表達量的影響

統(tǒng)計分析結果(表4)表明，飼料中添加AKG極顯著影響PPARγmRNA在草魚肝胰臟中的表達(P＜0.01)，顯著影響 PPARγmRNA 在草魚鰓、脾臟、腎臟中的表達(P＜0.05)。隨著飼料中AKG添加量的增加，PPARγmRNA在肝胰臟中的相對表達量規(guī)律性不明顯，但0.25%AKG組肝臟中PPARγmRNA的相對表達量最高，并極顯著高于其他各組(P＜0.01);與對照組相比，各AKG添加組鰓中PPARγmRNA的相對表達量均有所增加，但僅1.00%AKG組與對照組達到顯著差異(P＜0.05);飼料中添加AKG顯著降低了PPARγmRNA在腎臟中的相對表達量(P＜0.05)，但各AKG添加組間差異不顯著(P＞0.05);隨著飼料中AKG添加量的增加，PPARγmRNA在脾臟中的相對表達量規(guī)律性不明顯，但 0.75%AKG組脾臟中PPARγmRNA的相對表達量最高，并極顯著高于其他各組(P＜0.01)。

3 討論

HSP70作為HSP家族中起重要作用的一員，關于其功能方面的研究已經(jīng)有很多報道，在哺乳動物中都集中于其作為分子伴侶的作用，即幫助蛋白質折疊以及蛋白質轉運［23］。HSP70還具有保護細胞免受損傷，增強機體對應激的抵抗力的作用;同時，其在抗細胞凋亡、抗氧化和免疫反應中也起著重要作用［24］。Lee 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，HSP70的過量表達可以調節(jié)和抑制間質金屬蛋白酶(應激時產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，能加速細胞死亡和組織損傷)的活性來減少細胞、組織在缺氧應激情況下的損傷。Nakano等［26］研究發(fā)現(xiàn)，當潮間帶杜父魚體內HSP70含量較高時，機體具有更強的抗應激能力，能適應較大范圍的溫差變化。HSP70在細胞內的高表達或數(shù)量的增多可以改善細胞的生存能力，提高應激耐受力。石君霞等［27］研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ對緩解仔豬炎癥反應有一定作用，PPARγ可抑制腫瘤壞死因子－α(TNF-α)和白細胞介素－6(IL-6)等促炎癥細胞因子的形成，通過調控這些細胞因子的釋放，從而減輕炎癥反應。研究表明，PPARγ信號是重要的免疫調節(jié)途徑，PPARγ信號影響著吞噬作用、細胞因子的生成及抗原呈遞［15，28］。本試驗結果表明，草魚免疫器官腎臟和主要代謝器官肝胰臟中 HSP70、PPARγ mRNA的相對表達量均較高，這與周小飛［29］、陳亮等［21］的研究結果相似，與 HSP70和 PPARγ主要參與免疫反應和代謝調控的功能相符。在脾臟中，飼料中 AKG添加量為 0.75%時，HSP70和PPARγmRNA相對表達量顯著或極顯著高于對照組。這說明在草魚飼料中添加適量的AKG能上調HSP70和PPARγmRNA的表達，草魚的應激耐受力和免疫能力呈現(xiàn)上升的趨勢，從而有利于草魚的生長。本試驗的生長性能數(shù)據(jù)和免疫指標數(shù)據(jù)也表明在飼料中添加適量AKG后草魚免疫能力增強，生長性能顯著提高［30］。本試驗中，各AKG添加組草魚腎臟中HSP70和PPARγmRNA的相對表達量均顯著低于對照組，這是否是由于腎臟可能通過某些特殊的負調控機制參與HSP70和PPARγmRNA的表達調控還有待進一步探討。

表3 飼料中添加AKG對草魚HSP70 mRNA相對表達量的影響Table 3 Effects of dietary AKG on HSP70 mRNA relative expression level of grass carp

表4 飼料中添加AKG對草魚PPARγmRNA相對表達量的影響Table 4 Effects of dietary AKG on PPARγmRNA relative expression level of grass carp

4 結論

① HSP70和PPARγmRNA的相對表達量在草魚不同組織中存在差異，二者均在腎臟中高度表達，HSP70 mRNA的相對表達量在腎臟、肝胰臟、脾臟、鰓中依次降低，而PPARγmRNA的相對表達量在腎臟、肝胰臟、鰓、脾臟中依次降低。

②飼料中添加AKG顯著或極顯著影響HSP70 mRNA在鰓、腎臟、脾臟中的表達和PPARγ mRNA在鰓、肝胰臟、腎臟、脾臟中的表達。

③ 建議草魚(體重在35 g左右)飼料中AKG的添加量為0.75%。

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