谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉腸道消化酶活性及腸道形態(tài)的影響

李晉南 徐奇友 王常安 羅 亮 趙志剛

近年來，谷氨酰胺(glutamine，Gln)因其獨特的生理功能逐漸成為營養(yǎng)學、生理學和免疫學等學科的研究熱點。研究表明，Gln可以增加免疫功能、維持酸堿平衡、增加細胞體積和增強肌肉細胞內蛋白質的合成等［1］。在許多物種中，腸黏膜和其他迅速增生的細胞(如免疫細胞)的主要能量來源是Gln，而非葡萄糖。因此，腸道是Gln最主要的消耗器官［2］，但腸黏膜本身既不能產生也無法儲存Gln，因此適當的補充Gln可以增加腸絨毛高度、降低腸黏膜通透性和增強腸免疫功能［3］。然而，Gln在水溶液中極不穩(wěn)定，受熱易分解成有毒的焦谷氨酸和氨，從而限制了它的使用。因此，本研究選擇 α－酮戊二酸(α-ketoglutarate，AKG)、鳥氨 酸 － α － 酮 戊 二 酸 (ornithine-α-ketoglutarate，OKG)和谷氨酸(glutamate，Glu)3種 Gln的前體物，研究它們對松浦鏡鯉腸道消化酶活性及腸道形態(tài)的影響，旨在探討Gln前體物替代Gln的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

AKG 和 Glu購自 Sigma，純度≥98.5%;Gln購自哈爾濱百事達生物公司;OKG購自溧陽市開拓者化學技術服務中心。

1.2 試驗設計及飼糧

試驗選擇規(guī)格一致的初始體重為(97.33±6.74)g的健康松浦鏡鯉(選自中國水產科學研究院黑龍江水產研究所)270尾。預試2周后隨機分為6組，4個試驗組分別為AKG組、OKG組、Gln組、Glu組，同時以魚粉(FM)組和植物蛋白質(PM)組為對照組，每組設3個重復，每個重復15尾魚。試驗期為60 d。

FM組以魚粉和豆粕為蛋白質源，PM組以豆粕代替魚粉為蛋白質源，同時用L－蛋氨酸、賴氨酸和L－蘇氨酸調節(jié)氨基酸平衡，魚油和豆油為脂肪源，羧甲基纖維素為黏合劑，配制成等氮等能飼料。各試驗組在植物蛋白質飼料基礎上分別添加1.5%AKG、OKG、Gln 和 Glu。具體飼料組成及營養(yǎng)水平見參考文獻［4］。飼料原料經粉碎按配比混合均勻，少量的組分采用逐級擴大法混合，然后用顆粒機制成2 mm顆粒飼料，置于－20℃冰箱中保存待用。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗期間每天定時投喂3次，每次投喂以飽食無殘餌為準。試驗在室內控溫循環(huán)水族箱里進行，溫度為(24±1)℃，24 h不間斷供氧，溶氧大于5 mg/L，每日吸污，每周換去水族箱內2/3水并注入已曝氣的水，每日觀察記錄魚攝食和死亡情況。

1.4 腸道消化酶活性的測定

飼養(yǎng)試驗結束后，停食24 h，每缸隨機選取3尾魚，置于冰盤中迅速解剖，分別取前腸、中腸和后腸，用冰浴的0.86%生理鹽水洗凈腸道中的內容物，濾紙吸干水分，測量腸重。按1∶9質量體積比加入生理鹽水，以FJ－200CL高速組織勻漿機勻漿，4℃條件下4 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于1.5 mL離心管中，－20℃保存待測蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。

蛋白酶活性測定采用福林－酚(Folin-phenol)法，以0.5%酪素作底物，將1 mL酶粗提液(對照管為1 mL去離子水)在37℃預熱5 min后，加入2 mL預熱的0.5%酪素，37℃反應15 min，然后加入10%三氯乙酸3 mL，終止反應，離心取上清液1 mL加入 0.55 mol/L Na2CO35 mL，再加1 mL福林－酚試劑，在37℃水浴中顯色15 min，680 nm波長下比色，以對照管調零，測吸光度。用同樣的方法計算出標準酪氨酸－吸光度的回歸方程，運用回歸方程計算經酶分解酪素所產生的酪氨酸的量(μg)。蛋白酶活性單位定義:在37℃下，每分鐘水解酪素產生相當于1μg酪氨酸所需的酶量為1個酶活性單位。

淀粉酶和脂肪酶活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定，具體方法參見試劑盒說明書。淀粉酶活性單位定義:在37℃下，組織中每毫克蛋白質與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個酶活性單位。脂肪酶活性單位定義:在37℃下，每克組織蛋白質在本反應體系中與底物反應1 min，每消耗1μmol底物為1個酶活性單位。

1.5 腸道形態(tài)的測定

腸道組織切片的制備:飼養(yǎng)試驗結束后，每組隨機選取3尾魚，置于冰盤中迅速解剖，分別取前腸、中腸和后腸，以0.86%的生理鹽水沖洗干凈，固定于Bouin氏液中。固定24 h后，經過乙醇逐級脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(5μm)、蘇木精－伊紅(HE)染色、脫水、透明、中性樹脂封片。用LeicaMD 4000B顯微鏡觀察并拍照，圖像由Motic Images Plus 2.0軟件進行測量，每段腸樣測量15個以上完整皺襞高度、絨毛寬度和肌層厚度，分別取其平均值作為該樣品各指標的測定結果。

腸道指標的計算方法:飼養(yǎng)試驗結束后，每組隨機選取3尾魚，測量試驗魚體重、體長、腸重和腸長，計算腸體指數(intestinal somatic index，ISI)、腸長指數(intestinal length index，ILI)。

腸體指數(%)=(腸重/體重)×100;

腸長指數(%)=(腸長/體長)×100。

1.6 統(tǒng)計分析

數據用平均值±標準差表示。試驗結果用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較，顯著性水平P值為0.05。

2 結果

2.1 Gln及其前體物對松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響

由表1可知，各組間前腸和中腸的蛋白酶活性沒有顯著差異(P＞0.05);Glu組后腸的蛋白酶活性顯著低于 FM 組(P＜0.05)。OKG組和 Gln組前腸的淀粉酶活性顯著高于FM組和PM組(P＜0.05);Glu組中腸的淀粉酶活性顯著低于FM組、PM 組和 Gln 組(P＜0.05);同樣，Glu 組后腸的淀粉酶活性最低，且顯著低于AKG組和FM組(P＜0.05)。各組間中腸和后腸的脂肪酶活性沒有顯著差異(P＞0.05);Glu組前腸的脂肪酶活性顯著高于 Gln組、OKG組、FM 組和 PM 組(P＜0.05);AKG組前腸的脂肪酶活性顯著高于FM組和 OKG 組(P＜0.05)。

表1 Gln及其前體物對松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響Table 1 Effects of Gln and its precursors on intestinal digestive enzyme activity of Songpu mirror carp U/g prot

2.2 Gln及其前體物對松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響

由表2可知，各組間腸長指數沒有顯著差異(P＞0.05)。AKG 組、Gln 組、Glu 組及 PM 組的腸體指數顯著高于FM 組(P＜0.05)，OKG組的腸體指數與FM組差異不顯著(P＞0.05)。各組間中腸和后腸的皺襞高度沒有顯著差異(P＞0.05)，Gln組前腸的皺襞高度顯著低于AKG組、PM組和FM組(P＜0.05)。各組間各腸段的腸絨毛寬度差異不顯著(P＞0.05)。各組間前腸和后腸的肌層厚度差異不顯著(P＞0.05)，AKG組的中腸肌層厚度顯著高于FM 組(P＜0.05)，其他各組間差異不顯著(P＞0.05)。

各組前腸組織切片如圖1所示，AKG組的腸絨毛發(fā)育良好，排列整齊緊密，因此增加了腸道的吸收面積，也有利于腸道的健康。Gln組的前腸腸絨毛排列緊密，密度比FM組有所增加，但皺襞高度下降，OKG組和Glu組前腸腸絨毛密度與FM組沒有明顯差異。

3 討論

Gln具有重要的生理作用，尤其是在腸道組織，但其在溶液中和某些生理狀態(tài)下不穩(wěn)定，且在臨床中很難掌握［5－6］。為了避免這些問題，我們選取AKG、OKG和 Glu等 Gln的前體物。AKG和Gln都是三羧酸循環(huán)中的中間產物，AKG通過轉氨作用生成Glu，Glu再進一步形成Gln，這種轉化是非?？焖俚?。因AKG在生理狀態(tài)和溶液中很穩(wěn)定且是無毒的，因此更適于替代Gln［6］。Glu穩(wěn)定性雖然好，但是有神經毒性，能導致“中國餐館綜合征”，并且不易通過細胞膜［7］。OKG是由1分子的AKG和2分子的鳥氨酸組成，研究表明OKG能阻止肌肉中Gln的減少，增加蛋白質的合成代謝，減少肌肉消耗［8］。

腸道是魚類營養(yǎng)消化吸收的重要場所，因此腸道的重量、腸道的皺襞高度和各消化酶活性與動物體的生長發(fā)育和營養(yǎng)物質的消化吸收有重要的關系。以往的研究發(fā)現，飼料中添加Gln可以促進陸生動物腸道發(fā)育和提高消化酶活性［9－13］。在水生動物的研究中，同樣表明添加Gln可以改善生長性能、腸道發(fā)育和免疫力［14－16］。Lin 等［17］發(fā)現飼料中添加Gln可以增加建鯉幼魚體增重、攝食量、腸道重量、腸絨毛高度、堿性磷酸酶和鈉鉀ATP酶活性。本試驗的FM組飼料組成中魚粉20%，豆粕34%，粗蛋白質30.71%，PM 組飼料組成中豆粕62%，粗蛋白質30.81%，各試驗組在PM組基礎上分別添加1.5%的Gln及其前體物［4］。本試驗的研究結果顯示，添加Gln前體物AKG組、Glu組和Gln組的腸體指數比FM組有顯著的提高，但與PM組相比差異不顯著，這一結果可能是由于基礎飼料的不同而引起的。但是本試驗的結果顯示它們并沒有顯著的增加腸絨毛高度，這一結果與徐奇友等［16］研究的Gln對虹鱒稚魚腸道形態(tài)的影響結果一致，其研究表明在12周時，添加1.0%和2.0%Gln顯著降低了虹鱒稚魚腸道的皺襞高度。其原因可能是由于Gln的不穩(wěn)定性，在配制飼料的過程中或其他不穩(wěn)定的情況下，如水溶液中，會產生有毒的焦谷氨酸和氨，本試驗結果從皺襞高度和切片結果都可以看出，腸絨毛發(fā)育受到了抑制，其原因可能是由于添加的Gln沒有發(fā)揮作用，反而起到了抑制作用。因此限制了Gln在水產動物飼料中的應用。AKG組前腸的皺襞高度與對照組相比差異不顯著，且從切片中可以看出，AKG組腸絨毛致密程度增加，細長且排列整齊，這樣可以增加腸道的吸收面積，AKG組中腸的肌層厚度顯著高于FM組，肌肉層的環(huán)肌層部分對腸的蠕動較為有利，AKG組肌層厚度增加在一定程度上促進了腸道的蠕動，提高了營養(yǎng)物質的吸收利用。在之前的研究表明，AKG組的增重率和蛋白質沉積效率分別比 PM組提高 5.96%和16.89%，AKG組試驗動物的生長性能略優(yōu)于其他添加組［4］，AKG組腸道結構的改善可以解釋這一現象。

表2 Gln及其前體物對松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響Table 2 Effects of Gln and its precursors on intestinal morphology of Songpu mirror carp

圖1 松浦鏡鯉前腸組織切片Fig.1 Tissue slice of foregut of Songpu mirror carp

Lin等［17］等對建鯉幼魚的研究也表明，魚腸道蛋白酶和脂肪酶活性隨飼料Gln添加量上升而提高。而高進等［18］的研究表明，飼料中添加Gln對大黃魚稚魚消化酶活性沒有顯著影響。徐奇友等［19］的研究表明，飼料中添加 0.25%～1.00%Ala-Gln顯著提高哲羅魚仔魚的腸脂肪酶活性。本研究的結果顯示，添加1.5%的OKG和Gln顯著提高了前腸的淀粉酶活性，Glu和AKG顯著提高了前腸的脂肪酶活性。這一結果說明Gln及其前體物可以顯著改善鯉魚前腸消化酶活性。

4 結論

Gln及其前體物可以顯著改善松浦鏡鯉前腸淀粉酶和脂肪酶活性。

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