蛋白酶對(duì)8～21日齡肉仔雞生長性能、氨基酸表觀消化率及腸道組織形態(tài)的影響

周 梁 張海軍 王 晶 鄭旭陽 齊廣海* 武書庚*

我國2012年進(jìn)口大豆5 838萬t，蛋白質(zhì)原料對(duì)外依存度大于80%，使得近年來我國飼料成本居高不下，養(yǎng)殖效益難以保障，動(dòng)物對(duì)飼料營養(yǎng)物質(zhì)的利用率不足40%。鑒于此，利用蛋白酶提高蛋白質(zhì)的利用率日益得到重視。研究表明，在當(dāng)前的原料價(jià)格水平下，應(yīng)用蛋白酶可降低飼料成本，提高畜禽養(yǎng)殖收益［1］。另外，蛋白質(zhì)利用率的提高還能減少氮的排放，減輕環(huán)境污染。市場上常見的蛋白酶制劑主要有復(fù)合型和單組分型。復(fù)合型蛋白酶制劑以蛋白酶為主要成分，可提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率和肉仔雞生長性能［2－4］，但較難定義蛋白酶的具體作用。所以，研究單組分型蛋白酶對(duì)動(dòng)物生長性能的影響并評(píng)價(jià)蛋白酶的作用，得到了學(xué)者的認(rèn)可。近年來，學(xué)者對(duì)新型絲氨酸蛋白酶［1］的研究較多，該蛋白酶源自諾卡式菌，由地衣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)而來，能有效提高動(dòng)物飼糧中特定氨基酸的消化率，緩解低蛋白質(zhì)(低氨基酸)飼糧對(duì)動(dòng)物生長速度的影響［2，5］，提高動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)尤其是蛋白質(zhì)的消化率［6］。但目前針對(duì)此蛋白酶的研究均以低蛋白質(zhì)飼糧為基礎(chǔ)，就其對(duì)飼喂正常營養(yǎng)水平飼糧動(dòng)物的作用效果及其適宜添加水平的研究較少。本試驗(yàn)在實(shí)際生產(chǎn)條件下，研究正常營養(yǎng)水平飼糧中不同添加水平的蛋白酶對(duì)肉仔雞生長性能、氨基酸表觀消化率及腸道組織形態(tài)的影響，為蛋白酶在肉仔雞生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與基礎(chǔ)飼糧

試驗(yàn)選擇1日齡愛拔益加(AA)肉仔雞850只(公母各占1/2)，于環(huán)境可控、持續(xù)光照的雞舍內(nèi)飼養(yǎng)至7日齡，逐只稱重，選擇體重相近、健康的560只(公母各占1/2)肉仔雞隨機(jī)分為5組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)14只雞，各組初始體重經(jīng)檢驗(yàn)差異不顯著(P＞0.05)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加 0.01%、0.02%、0.04%和 0.08%蛋白酶的試驗(yàn)飼糧，試驗(yàn)期14 d。

參照 NRC(1994)、《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)及《中國飼料成分及營養(yǎng)價(jià)值表》(2011)，結(jié)合《AA肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊》配制玉米－豆粕－肉骨粉型基礎(chǔ)飼糧(表1)，蒸汽制粒。為方便測定營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率，提高飼糧中鹽酸不溶性灰分(AIA)標(biāo)記物含量，飼糧中添加1.25%的硅藻土(SiO2＞90%)。在配制添加蛋白酶試驗(yàn)飼糧時(shí)，以蛋白酶替代等量的硅藻土。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞采用4層籠養(yǎng)，自然光照加人工補(bǔ)光，光照強(qiáng)度30 lx。第1周雞舍溫度33～35℃，而后每周降低2～3℃。飼養(yǎng)管理依據(jù)《AA肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊》進(jìn)行，常規(guī)免疫，自由飲水和采食。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

生長性能:每日觀察雞群的生長、發(fā)病及死亡狀況，記錄死淘數(shù)。在20日齡的22:00禁食，期間自由飲水，次日08:00，以重復(fù)為單位稱重、結(jié)料。計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air－dry basis) %

粗蛋白質(zhì)及氨基酸表觀消化率:于21日齡隨機(jī)從每個(gè)重復(fù)中選取肉仔雞公、母各1只，頸脫節(jié)致死，取回腸(卵黃囊遺跡到回盲結(jié)合部的后段2 cm)內(nèi)容物，冷凍，凍干，研磨，過 0.5 mm 篩，4℃保存。

測定飼糧和回腸食糜中的粗蛋白質(zhì)、AIA和氨基酸含量。粗蛋白質(zhì)含量使用KDY－9830型自動(dòng)凱氏定氮儀測定;AIA含量根據(jù)GB/T 23742—2009/ISO5985:2002的方法測定;氨基酸含量(17種)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所中心分析室測定。粗蛋白質(zhì)表觀消化率(%)=［1－(飼糧中指示劑含量/食糜中指示劑含量)×(食糜中粗蛋白質(zhì)

含量/飼糧中粗蛋白質(zhì)含量)］×100;氨基酸表觀消化率(%)=［1－(飼糧中指示劑含量/食糜中指示劑含量)×(食糜中氨基酸

含量/飼糧中氨基酸含量)］×100。

腸道組織形態(tài):各段小腸稱重，分別將十二指腸、空腸和回腸的近端腸段剪下長3 cm的組織樣，用冰冷的生理鹽水緩緩沖洗干凈，浸入4%福爾馬林溶液，4℃保存，以備制作石蠟切片。電鏡觀測小腸絨毛高度、隱窩深度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 16.0軟件的 one－way ANOVA程序統(tǒng)計(jì)分析，Duncan氏法進(jìn)行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 蛋白酶對(duì)肉仔雞生長性能的影響

由表2可知，隨蛋白酶添加水平增加，肉仔雞的ADG呈先升高后降低的二次曲線關(guān)系(P＜0.05)，0.02%蛋白酶組最高，較對(duì)照組提高了6.7%(P＜0.05);飼糧添加蛋白酶提高了肉仔雞的ADFI，各蛋白酶組肉仔雞ADFI均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);各組之間 F/G差異不顯著(P＞0.05)。

表2 蛋白酶對(duì)肉仔雞生長性能的影響Table 2 Effects of protease on growth performance of broilers

2.2 蛋白酶對(duì)肉仔雞粗蛋白質(zhì)及氨基酸表觀消化率的影響

由表3可知，蛋白酶可二次性提高肉仔雞對(duì)粗蛋白質(zhì)的表觀消化率(P=0.005)，0.02%蛋白酶組較對(duì)照組提高了8.7%(P＜0.05);蛋白酶可二次性提高氨基酸(亮氨酸和異亮氨酸除外)的表觀消化率(P＜0.05)。

0.01 %和0.02%蛋白酶組甘氨酸的表觀消化率較對(duì)照組顯著提高了 8.8%及 10.6%(P＜0.05)。所有蛋白酶組的蛋氨酸表觀消化率及除0.08%蛋白酶組外其他各蛋白酶組的酪氨酸表觀消化率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。0.01%和 0.02%蛋白酶組天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸的表觀消化率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。所有蛋白酶組肉仔雞粗蛋白質(zhì)和天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸的表觀消化率均呈顯著先升高后降低的二次曲線關(guān)系(P＜0.05)，其中除酪氨酸、蛋氨酸表觀消化率以0.01%蛋白酶組最高外，其余均以0.02%蛋白酶組最高。

表3 蛋白酶對(duì)肉仔雞粗蛋白質(zhì)和氨基酸表觀消化率的影響Table 3 Effects of protease on apparent digestibiliy of crude protein and amino acids of broilers

2.3 蛋白酶對(duì)肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響

由表5可知，各組之間十二指腸絨毛高度差異不顯著(P＞0.05);隨蛋白酶添加水平增加，十二指腸隱窩深度呈顯著線性升高(P＜0.05)，以0.08%蛋白酶組最深，顯著深于除0.04%蛋白酶組外的其他各組(P＜0.05);隨蛋白酶添加水平增加，十二指腸絨毛高度/隱窩深度(V/C)呈顯著線性降低(P＜0.05)，其中 0.08%蛋白酶組顯著低于除0.04%蛋白酶組外的其他各組(P＜0.05)，0.01%、0.02%、0.04%蛋白酶組與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)。

空腸形態(tài)隨蛋白酶添加水平升高，絨毛高度呈二次曲線升高(P＜0.05)，0.01%、0.02%、0.04%蛋白酶組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，0.08%蛋白酶組與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05);隱窩深度呈線性升高(P＜0.05)，0.08%蛋白酶組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);各組之間 V/C差異不顯著(P＞0.05)。

回腸形態(tài)方面，各組之間絨毛高度和隱窩深度無顯著差異(P＞0.05)，但 0.02%蛋白酶組的 V/C 最高，顯著高于 0.04%蛋白酶組(P＜0.05)。

表4 蛋白酶對(duì)肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響Table 5 Effects of protease on intestinal morphology of broilers

3 討論

3.1 蛋白酶對(duì)肉仔雞生長性能的影響

本試驗(yàn)表明，在玉米－豆粕－肉骨粉型飼糧中添加蛋白酶，肉仔雞ADG以0.02%蛋白酶組最高，且有顯著先升高后降低的二次曲線關(guān)系，與蛋白酶添加水平升高肉仔雞生長性能呈二次曲線變化的結(jié)果［5］相吻合，與玉米－豆粕型飼糧添加復(fù)合蛋白酶顯著提高肉仔雞ADG但不影響ADFI的結(jié)果［3］不一致。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋白酶能顯著提高8～21日齡肉仔雞的ADFI，可能是因?yàn)榈鞍酌傅奶砑咏档土耸趁拥酿ざ榷欣谄湓谀c道的蠕動(dòng)［7］。另有研究表明，蛋白酶可提高肉仔雞對(duì)低蛋白質(zhì)飼糧的利用效率［7］，改善低蛋白質(zhì)對(duì)肉仔雞生長性能造成的影響［2］，且與其他單組分型酶共同使用能有效提高肉仔雞的ADFI和ADG［8］;單獨(dú)使用時(shí)，也能達(dá)到正常蛋白質(zhì)水平飼糧的飼料效率。然而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然0.02%、0.04%蛋白酶組飼料轉(zhuǎn)化效率較高，但均未顯著高于對(duì)照組。其主要因可能有2點(diǎn):1)飼糧類型不同。本試驗(yàn)采用玉米－豆粕－肉骨粉型飼糧，而以往的研究除玉米－豆粕型［2］外，主要成分還涉及小麥［9］、黑小麥［10］和干酒糟及其可溶物(DDGS)［11］等，對(duì)于不同的作用底物，蛋白酶作用效果不盡相同。2)試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同。本試驗(yàn)采用正常蛋白質(zhì)、能量水平的飼糧，與低蛋白質(zhì)飼糧相比，飼料轉(zhuǎn)化效率的改善效果可能不夠明顯，具體原因還有待進(jìn)一步探究。本試驗(yàn)結(jié)果提示，飼糧添加0.02%蛋白酶即可改善肉仔雞生長前期生長性能。

3.2 蛋白酶對(duì)肉仔雞粗蛋白質(zhì)及氨基酸表觀消化率的影響

蛋白酶可提高斷奶仔豬的飼糧氨基酸表觀消化率［12］，提高生長育肥豬氮的回腸表觀消化率［13］，提高肉仔雞粗蛋白質(zhì)［2］、能量［14］、氮［15］、淀粉［15］和脂肪酸［10］的表觀消化率和真代謝能的利用率［14］。本試驗(yàn)探討了蛋白酶對(duì)粗蛋白質(zhì)和17種氨基酸的表觀消化率，結(jié)果表明，正常營養(yǎng)水平的玉米－豆粕－肉骨粉型飼糧中添加不同水平蛋白酶可影響21日齡肉仔雞粗蛋白質(zhì)及氨基酸的表觀消化率，且整體呈現(xiàn)先升高后降低的二次曲線關(guān)系，以0.02%蛋白酶組效果最佳。研究表明，飼用蛋白酶可通過補(bǔ)充內(nèi)源蛋白酶的不足，并與之協(xié)同作用來提高蛋白質(zhì)利用效率［16］。本試驗(yàn)肉仔雞氨基酸利用率的提高，可能由于肉仔雞生長前期的消化系統(tǒng)發(fā)育還不夠完善，適量添加外源蛋白酶后補(bǔ)充了內(nèi)源蛋白酶的分泌不足。但當(dāng)添加超過一定水平后，則可能反饋性的抑制內(nèi)源蛋白酶分泌，影響消化酶的活性［17］，故本試驗(yàn)中高添加水平的蛋白酶未起到提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率的作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，0.01%、0.02%蛋白酶組可提高生長前期肉仔雞粗蛋白質(zhì)及氨基酸的表觀消化率。

3.3 蛋白酶對(duì)肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響

家禽小腸絨毛是各種養(yǎng)分吸收的主要場所。小腸絨毛高度與細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，絨毛變長則擴(kuò)大細(xì)胞表面積，有利于營養(yǎng)物質(zhì)吸收;絨毛短時(shí)成熟的絨毛細(xì)胞減少，對(duì)養(yǎng)分的吸收能力降低。隱窩深度反映了細(xì)胞增殖率，隱窩變淺表明腸上皮細(xì)胞成熟率上升，吸收功能增強(qiáng)。因此V/C可綜合反映小腸的功能狀態(tài)，V/C上升則表示黏膜得到改善，消化吸收功能增強(qiáng)［17］。

研究表明，適量酶制劑能提高肉仔雞的絨毛高度［18］，但過量則不利于肉仔雞腸道發(fā)育［17，19］。另外飼糧蛋白酶可改善球蟲感染肉仔雞腸道黏液層厚度，影響腸壁形態(tài)［20］，且與木聚糖酶共同使用可降低回腸相對(duì)長度［9］。本試驗(yàn)表明，飼糧中添加0.08%蛋白酶顯著提高了21日齡肉仔雞空腸隱窩深度，降低了V/C，提示高添加水平蛋白酶不利于生長前期肉仔雞腸道的發(fā)育。0.02%蛋白酶組肉仔雞十二指腸、空腸和回腸的V/C均最高，且空腸的絨毛高度極顯著高于對(duì)照組，空腸和回腸的隱窩深度顯著低于對(duì)照組，可見，飼糧適宜添加水平蛋白酶有利于改善肉仔雞腸道組織形態(tài)，提高腸道消化吸收效率。綜合腸道組織形態(tài)結(jié)果可知，蛋白酶可二次性提高肉仔雞生長前期的ADG，與適量蛋白酶改善肉仔雞的腸道組織形態(tài)有關(guān);高添加水平蛋白酶對(duì)肉仔雞前期生長不利，與腸道形態(tài)發(fā)育不佳一致，也可能與蛋白酶活性降低［17］有關(guān)，但具體的確切作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①玉米－豆粕－肉骨粉型基礎(chǔ)飼糧中添加蛋白酶能顯著提高肉仔雞生長前期ADFI，提高肉仔雞粗蛋白質(zhì)及氨基酸的表觀消化率，

②0.02%蛋白酶組有利于肉仔雞腸道組織發(fā)育，0.08%蛋白酶組則不利于肉仔雞腸道組織發(fā)育。

③本試驗(yàn)條件下，蛋白酶的適宜添加水平為0.02%。

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