普安銀鯽早期發(fā)育過程中消化酶活性變化及外源維生素C對其的影響

蔣左玉 姚俊杰 熊鏵龍

維生素C(vitamin C)又名抗壞血酸，是一種具有廣泛生理和免疫作用的調(diào)節(jié)因子，是維持魚類正常生理功能必不可少的微量營養(yǎng)素，能促進養(yǎng)殖動物快速生長。目前，補充魚類維生素的方法有2種:一是向魚類飼料中添加，這種方法應用較為廣泛;二是通過維生素浸泡［1］。對于開口攝食以后的魚類來說，可以通過飼料補充維生素C，而對于魚類的胚胎和卵黃囊仔魚發(fā)育階段來說，在未開口攝食前營養(yǎng)物均來自卵黃，浸泡是獲取維生素C的有效途徑。目前，關于維生素C對魚類消化酶活性影響的研究主要集中在成魚，而將維生素C加入孵化水體中研究對胚胎和卵黃囊仔魚的影響尚未見報道。已有研究表明，飼料中適宜水平的維生素C能促進魚類發(fā)育和提高免疫力，增加魚的活力與攝食，從而提高腸道消化酶活性，促進消化。在黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)飼料中分別添加1 014 mg/kg維生素C磷酸酯鈣鹽和919 mg/kg包被維生素C時，腸道蛋白酶活性達到最大值;而添加量分別為747和507 mg/kg時，腸道淀粉酶活性達到最大值;維生素C磷酸酯鈣鹽添加量為300 mg/kg時，腸道脂肪酶活性最高［2］。對建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)仔魚的研究也表明，飼料中維生素C添加量為150 mg/kg可使建鯉腸道的胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性達到最大值［3］。當飼料維生素C含量分別達46.9和45.1 mg/kg時，建鯉仔魚腸道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性分別達到最高平臺期;而當添加量分別為 44.4、48.9 和 44.8 mg/kg 時，胰臟胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性也達到最高平臺期［4］。對于孵化后1～15 d的鯪魚(Labeo rohita)水花，飼料中維生素C添加量從750 mg/kg增至2 000 mg/kg時，其腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性隨之升高［5］。

普安銀鯽(Carassius auratus)屬鯉形目，鯉科，鯉亞科，鯽魚屬，是在貴州省普安縣青山鎮(zhèn)一帶獨特高原環(huán)境條件下形成的一種天然雌核發(fā)育鯽魚。其與黑龍江方正銀鯽(C.auratus gibelio)同屬于天然雌核發(fā)育的鯽魚，但它們并非同一來源，而是在貴州省普安縣青山鎮(zhèn)一帶獨特高原環(huán)境條件下形成的一個鯽魚類型或種群，成為貴州省寶貴的魚類種質(zhì)資源。用營天然雌核發(fā)育的普安銀鯽為母本，鯉為父本繁殖的子1代具有肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)豐富、生活力強、生長快、雜食性、群體產(chǎn)量高、育種簡便等特點，宜在池塘、稻田、山塘和水庫中養(yǎng)殖［6］。為了保護這一珍貴的種群，在本課題組前期對普安銀鯽人工繁殖、胚胎發(fā)育及仔魚生長特性等研究［7－9］的基礎上，本試驗探究了普安銀鯽早期發(fā)育過程中消化酶的活性變化以及維生素C浸泡對其的影響，旨在進一步認識消化酶在不同發(fā)育階段的消化生理特點，以便更好地了解仔魚消化生理及其營養(yǎng)需求，為普安銀鯽人工育苗的投餌和提高仔魚的成活率提供理論指導，進而為普安銀鯽的資源保護和開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗在貴州省普安縣普安銀鯽原種場進行，挑選性腺成熟度好的普安銀鯽雌魚30尾，全長(27.91±1.53)cm，體重(446.64±59.36)g;用興國紅鯉(Cyprinus carpio)作為父本進行異源授精，其體 長 (35.21±5.74)cm，體 重 (518.14±121.70)g。經(jīng)過人工催產(chǎn)、干法授精后將受精卵放在水箱(90 cm×50 cm×55 cm)內(nèi)孵化，水溫控制在24℃，每8 h全部換1次同濃度、同溫度新水。通過參考文獻［1］中的方法進行預試驗，預試驗中設置水體維生素 C濃度為 20、25、30和35 mg/L，進行胚胎孵化試驗，結(jié)果表明，在水體維生素C濃度為30 mg/L能顯著促進胚胎發(fā)育，縮短孵化時間，且出膜后仔魚生長良好，因此，正式試驗采用30 mg/L維生素C溶液進行胚胎孵化試驗。本試驗分為2組，孵化水體維生素C濃度分別為0(正常組)和30 mg/L(維生素C組)，每組3個重復，仔魚開口后投喂蛋黃。

用顯微鏡和解剖鏡對試驗材料進行連續(xù)觀察，記錄發(fā)育時間和發(fā)育時期。本試驗取樣標準為50%發(fā)育至某個時期為取樣點，仔魚的內(nèi)源營養(yǎng)期為1日齡，混合營養(yǎng)期為2～3日齡，外源營養(yǎng)期為4～5日齡。在成熟卵、受精卵、原腸中期、晶體出現(xiàn)期、混合營養(yǎng)期(3日齡)及外源營養(yǎng)期(5日齡)6個時期分別取樣，將樣品用濾紙吸干水分后放入1.5 mL的eppendoff管中，所得樣品立即置于－80℃冰箱保存。

1.2 樣品制備

取不同時期的胚胎(500～600個為1個重復)或仔魚樣品(500～600條為1個重復)，加入10倍體積(m/v)預冷重蒸水，在玻璃勻漿器中冰浴勻漿，9 000～10 000 r/min冷凍離心 30 min，上層為油層，下層為沉淀，小心取中間層，3 000 r/min再次離心后取上清液進行消化酶活性的測定。上清液置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，?4 h內(nèi)分析完畢。

1.3 酶活性測定方法

纖維素酶活性測定方法:試管中加入0.2 mol/L的醋酸緩沖液(pH 4.6)2 mL、0.5%羧甲基纖維素鈉5 mL、酶液0.4 mL。加入重蒸水使總體積為10 mL，于40℃水浴中糖化30 min，取出后立即置于沸水中煮沸10 min。所得糖化液按Somogyi－Nelson 方法測定［10］。

胰蛋白酶活性參考文獻［11］的方法測定。胃蛋白酶活性參考文獻［12］的方法測定。淀粉酶、脂肪酶活性參考文獻［13］的方法測定?？偟鞍缀繀⒖嘉墨I［14］的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤(n=3)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，用LSD多重比較分析試驗結(jié)果的差異顯著性，當P＜0.05時為差異顯著，P＞0.05時為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 普安銀鯽早期發(fā)育過程中總蛋白含量變化

普安銀鯽早期發(fā)育過程中總蛋白含量變化見表1，早期發(fā)育過程中，正常組呈下降的趨勢，由成熟卵的(0.705±0.041)mg/mL 下降至受精卵的(0.676±0.042)mg/mL，隨之下降至晶體出現(xiàn)期的(0.478±0.090)mg/mL，又急劇下降至混合營養(yǎng)期的(0.150±0.009)mg/mL，最終外源營養(yǎng)期時下降至(0.101±0.003)mg/mL。維生素 C 組總蛋白含量在整個早期發(fā)育中也呈下降的趨勢，由受精卵時期的(0.676±0.042)mg/mL 下降至晶體出現(xiàn)期的(0.556±0.020)mg/mL，又急劇下降至混合營養(yǎng)期的(0.283±0.014)mg/mL，最終下降至外源營養(yǎng)期的(0.189±0.037)mg/mL。

表1 普安銀鯽早期發(fā)育過程中總蛋白含量變化Table 1 The variation of total protein content of Carassius auratus during early development mg/mL

2.2 普安銀鯽成熟卵與受精卵消化酶活性變化

普安銀鯽的成熟卵和受精卵中5種消化酶活性變化見表2。成熟卵中胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶的活性分別為(0.182±0.005)U/mg prot、(0.357 ± 0.002)U/mg prot、(0.104±0.003)U/mg prot和(0.049±0.001)U/mg prot，經(jīng)人工異源授精后，這4種酶的活性分別 為 (0.188 ± 0.003)U/mg prot、(0.362 ±0.002)U/mg prot、(0.105±0.002)U/mg prot和(0.051±0.002)U/mg prot，授精前后差異不顯著(P＞0.05);成熟卵中淀粉酶活性為(0.147±0.004)U/mg prot，授精后活性增加，為(0.219±0.005)U/mg prot，差異顯著(P＜0.05)。

表2 普安銀鯽成熟卵與受精卵中消化酶活性變化Table 2 The variation of digestive enzyme activities in mature eggs and fertilized eggs of Carassius auratus U/mg prot

2.3 正常組普安銀鯽早期發(fā)育過程中消化酶活性的變化

普安銀鯽早期發(fā)育過程中消化酶活性變化見表3，正常組胰蛋白酶和淀粉酶活性分別由原腸中期的 (0.094± 0.005)U/mg prot和 (0.479±0.022)U/mg prot上升至外源營養(yǎng)期的(0.688±0.013)U/mg prot和 (1.423 ± 0.032)U/mg prot，各時期間差異均顯著(P＜0.05)。胃蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶活性分別從原腸中期的(0.446±0.007)U/mg prot、(0.178±0.004)U/mg prot和(0.051±0.001)U/mg prot稍上升至晶體出現(xiàn)期的(0.448±0.003)U/mg prot、(0.182±0.002)U/mg prot和(0.054±0.001)U/mg prot，表現(xiàn)為差異不顯著(P＞0.05);但從晶體出現(xiàn)期開始，這3種酶活性都大幅上升，至外源營養(yǎng)期時分別高達(2.410±0.004)U/mg prot、(0.642±0.005)U/mg prot和(0.069±0.001)U/mg prot，晶體出現(xiàn)期、混合營養(yǎng)期和外源營養(yǎng)期間差異均顯著(P＜0.05)。

表3 普安銀鯽早期發(fā)育過程中消化酶活性變化Table 3 The variation of digestive enzyme activities of Carassius auratus during early development U/mg prot

2.4 維生素C組普安銀鯽早期發(fā)育過程中消化酶活性的變化

由表3可見，胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性分別由原腸中期的(0.186±0.005)U/mg prot、(0.647 ± 0.001)U/mg prot、(0.184± 0.002)U/mg prot 和 (0.501 ±0.002)U/mg prot上升至外源營養(yǎng)期的(0.898±0.003)U/mg prot、(3.525 ± 0.004)U/mg prot、(0.718±0.002)U/mg prot和(1.493±0.003)U/mg prot，各時期間均為顯著差異(P＜0.05)。纖維素酶活性從原腸中期(0.051±0.001)U/mg prot稍上升至晶體出現(xiàn)期的(0.052±0.001)U/mg prot，表現(xiàn)為差異不顯著(P＞0.05);但從晶體出現(xiàn)期開始，至外源營養(yǎng)期其活性上升到(0.068±0.001)U/mg prot，晶體出現(xiàn)期、混合營養(yǎng)期和外源營養(yǎng)期間差異均顯著(P＜0.05)。

2.5 維生素 C對普安銀鯽早期發(fā)育過程中消化酶活性的影響

由表3可見，發(fā)育的同一時期，維生素C能顯著提高胰蛋白酶活性(P＜0.05)，尤其在外源營養(yǎng)期，維生素 C 組為(0.898±0.003)U/mg prot，正常組為(0.688±0.013)U/mg prot。發(fā)育的同一時期，維生素C能顯著提高胃蛋白酶活性(P＜0.05)，尤其混合營養(yǎng)期時，維生素 C 組為(2.849±0.032)U/mg prot，正 常 組 為 (1.636 ±0.001)U/mg prot。原腸中期，維生素C對脂肪酶活性均無顯著影響(P＞0.05)，但能顯著提高晶體出現(xiàn)期、混合營養(yǎng)期與外源營養(yǎng)期脂肪酶活性(P＜0.05)，至外源營養(yǎng)期時維生素 C 組為(0.718±0.002)U/mg prot，正 常 組 為 (0.642 ±0.005)U/mg prot。在混合營養(yǎng)期和外源營養(yǎng)期，維生素C能夠顯著提高淀粉酶活性(P＜0.05)，但在其他2個時期無顯著影響(P＞0.05)。維生素C能略降低纖維素酶活性，但影響不顯著(P＞0.05)。

3 討論

3.1 普安銀鯽早期發(fā)育過程中總蛋白含量變化規(guī)律

在胚胎發(fā)育和卵黃囊仔魚發(fā)育過程中，卵黃物質(zhì)被各種消化酶分解代謝，從而為胚胎發(fā)育提供能量，同時為組織、器官的形成提供原料。在普安銀鯽胚胎和卵黃囊仔魚發(fā)育過程中，其總蛋白含量總體上呈下降的趨勢。經(jīng)異源授精后發(fā)育至原腸中期，總蛋白含量呈緩慢下降趨勢，其原因為在此期間胚胎主要進行細胞的分裂和細胞的遷移，需要的能量相對少。而從晶體出現(xiàn)期發(fā)育至出膜1 d的仔魚，是細胞增殖、分化和組織構建等生命活動進行的關鍵時期［15］，同時仔魚在出膜時脫落的卵膜中也有部分蛋白質(zhì)，從而導致在此期間總蛋白含量急劇下降。出膜后的卵黃囊仔魚處于饑餓狀態(tài)，導致大量的蛋白質(zhì)被分解用于維持其基本的生命活動，總蛋白含量繼續(xù)呈下降趨勢，至混合營養(yǎng)期時仔魚開始攝食，由于仔魚攝食量很少，以致總蛋白含量繼續(xù)呈下降趨勢。維生素C是維持魚類正常生理功能必不可少的微量營養(yǎng)素，大多數(shù)魚自身均不能合成，只能通過外界攝取。本試驗采用30 mg/L維生素C對普安銀鯽整個胚胎和卵黃囊仔魚發(fā)育進行浸泡表明，整個發(fā)育過程中總蛋白含量也呈下降趨勢，但下降幅度比正常組小，說明維生素C進入機體中產(chǎn)生了正面作用。王文輝等［2］研究表明，在黃顙魚飼料中添加維生素C可以提高血漿總蛋白含量。本試驗中，對普安銀鯽進行浸泡試驗表明，在混合營養(yǎng)期與外源營養(yǎng)期時，30 mg/L維生素C能使普安銀鯽仔魚蛋白質(zhì)沉積量分別高于正常組5.81%和11.49%，說明維生素C可能在普安銀鯽混合營養(yǎng)期能誘導仔魚攝食量增加，從而促使蛋白質(zhì)在仔魚體內(nèi)沉積，但具體原因還有待進一步研究。

3.2 普安銀鯽早期發(fā)育過程中消化酶活性變化規(guī)律

碳水化合物是一種快速而有效的能源補充物質(zhì)，普安銀鯽成熟卵經(jīng)異源授精后淀粉酶活性上升了48.98%，而其余4種消化酶活性無顯著變化，顯示淀粉酶在普安銀鯽授精后優(yōu)先發(fā)揮作用分解卵黃中的碳水化合物為胚胎發(fā)育迅速提供能量。說明淀粉酶對普安銀鯽胚胎發(fā)育的起始發(fā)揮了主要作用。類似的研究結(jié)果在對羅氏沼蝦(Macrochium rosenberg)胚胎營養(yǎng)研究中也得到證明［16］。魚類胚胎、仔魚發(fā)育過程中消化酶的活性變化對于促進魚體的營養(yǎng)代謝發(fā)揮著至關重要的作用。本試驗結(jié)果表明，普安銀鯽的成熟卵細胞已經(jīng)有消化酶活性的存在，說明此時的酶是由母體帶來的，屬于母源性酶類，且在成熟卵里就保持了較高的活性，從而為胚胎發(fā)育的順利進行提供了保障。在整個胚胎發(fā)育過程中，5種消化酶活性總體上呈上升的趨勢，發(fā)育至晶體出現(xiàn)期時，胚體的形態(tài)會發(fā)生很大變化，此時許多器官已分化形成，需要利用較多卵黃蛋白質(zhì)，所以胰蛋白酶的活性顯著升高。對淡水魚類來說，在胚胎發(fā)育過程中，首先是以卵黃中的蛋白質(zhì)作為代謝的能量來源，其次才是脂質(zhì)［17］。本試驗中脂肪酶活性從晶體出現(xiàn)期開始明顯上升，說明此過程中各器官系統(tǒng)正處于快速發(fā)育階段，脂類被大量分解利用;卵黃囊仔魚發(fā)育至混合營養(yǎng)期與外源營養(yǎng)期時，脂肪酶其活性均很高，說明出膜后的仔魚，其蛋白質(zhì)己被大量分解利用而逐漸減少，此時脂類成為卵黃囊仔魚發(fā)育階段代謝的主要能量來源，這也見于其他淡水魚類的仔魚發(fā)育過程中［17－18］;同時出膜后的仔魚處于饑餓狀態(tài)，也導致仔魚大量消耗脂質(zhì)以維持其基礎代謝的需要。目前，已在在鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)等魚類發(fā)現(xiàn)存在纖維素酶活性［19］。Das等［19］指出內(nèi)源纖維素酶產(chǎn)生在消化道的前段，消化道后段的纖維素酶由微生物分泌產(chǎn)生。本試驗中檢測到了纖維素酶活性，尤其從晶體出現(xiàn)期開始，至外源營養(yǎng)期其活性顯著上升，在此期間是大量器官不斷建立和完善時期，可能引起消化道內(nèi)纖維素酶的分泌，說明纖維素酶的活動對仔魚的發(fā)育是有利的。

3.3 維生素 C對普安銀鯽早期發(fā)育過程中消化酶活性的影響

魚類胚胎發(fā)育是生命周期中最脆弱的時期，其質(zhì)量好壞直接決定著個體存活力，胚胎期生理代謝活動很活躍，在代謝過程中會產(chǎn)生大量的自由基，進而影響胚胎的發(fā)育。而維生素C作為一種強抗氧化劑和自由基清除劑，能夠保護胚胎免受氧化損傷，特別是保證卵膜結(jié)構的完整性，進而提高卵的質(zhì)量［20］。Terova 等［21－22］認為，在鱸魚(Dicentrarchus labrax L.)和鯛魚(Sparus aurata L.)魚卵中積累較多的維生素C后，會有效促進鯛魚的早期胚胎發(fā)育;當魚類的受精卵中積累一定的維生素C既可以保護卵子不被氧化損傷，也能調(diào)控胚胎發(fā)育過程中卵內(nèi)物質(zhì)和能量代謝。而本試驗采用適宜濃度的維生素C溶液浸泡普安銀鯽胚胎和卵黃囊仔魚，降低了機體的損傷，提高普安銀鯽胚胎及卵黃囊仔魚的免疫力，從而為整個發(fā)育過程中正常的代謝提供了保障。有研究表明，采用40 mg/L的維生素C溶液對六須鯰(Silurus glanis)卵黃囊仔魚進行浸泡表明，維生素C能促進卵黃物質(zhì)的吸收，促使仔魚提前8 h開口，并提高其成活率［1］，說明維生素C能進入卵黃囊仔魚體內(nèi)，通過誘導與卵黃物質(zhì)代謝相關的一些消化酶活性來加速卵黃物質(zhì)的分解代謝，以滿足自身生長發(fā)育的需求。魚類可通過促進或減緩酶的合成與分泌，形成新的代謝水平，以適應營養(yǎng)條件的改變［2］。如飼料中添加維生素C對黃顙魚的研究表明，維生素C能提高黃顙魚的免疫力，增強魚的活力和采食量，自然也提高了酶的活性，促進了消化［2］。本試驗采用30 mg/L維生素C對普安銀鯽胚胎發(fā)育及卵黃囊仔魚的發(fā)育過程進行浸泡能顯著的促進蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，說明在發(fā)育過程中維生素C能促進消化酶的活性來分解卵黃物質(zhì)為普安銀鯽早期發(fā)育提供能量。

4 結(jié)論

①普安銀鯽成熟卵經(jīng)異源授精后淀粉酶優(yōu)先發(fā)揮作用，分解卵黃中的碳水化合物為胚胎發(fā)育迅速提供能量

②胰蛋白酶、淀粉酶、胃蛋白酶和脂肪酶分解卵黃物質(zhì)，在器官形成及仔魚發(fā)育中起著主要作用。

③30 mg/L的維生素C能顯著提高胰蛋白酶、淀粉酶、胃蛋白酶和脂肪酶活性，并促進蛋白質(zhì)的沉積。

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