微RNAs在骨髓間充質干細胞向三胚層方向分化中的調控作用

岑曉霞，熊 俊(綜述)，冀凱宏※(審校)

(第二軍醫(yī)大學 1學員旅學員七隊， 2基礎部組織胚胎學教研室,上海 200433)

骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是近年來發(fā)現的一類存在于骨髓的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞。體外分離培養(yǎng)后在不同的誘導條件下，BMSCs具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞、神經細胞和肝細胞等多種細胞分化的能力[1]。微RNA(microRNAs miRNA)是一類內源性的非編碼RNA,能夠通過與靶信使RNA(mRNA)特異性結合而導致靶mRNA降解或抑制其翻譯,從而對基因進行轉錄后調控。采用cDNA克隆結合生物信息學分析是尋找miRNAs基因的經典方法，更加深入徹底地了解miRNAs對BMSCs的三胚層誘導分化作用，對揭示成體干細胞的譜系分化調節(jié)機制及其在臨床治療上的應用具有重要意義。

1 miRNAs的作用和生成過程

miRNAs是一類長度為19～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA特異性結合在轉錄后水平調控基因表達。最早的兩個miRNAs(lin-4和let-7)是在研究C.elegans的發(fā)育調控時發(fā)現的。miRNAs基因在動物基因組中約占1%，卻可能參與調控至少30%的相關基因的表達，可見miRNAs在生物體生長發(fā)育過程中的重要性[2]。miRNAs在真核生物細胞的基因表達、細胞周期調控和個體發(fā)育等多種行為上起重要調控作用，并且與干細胞的多潛能性維持和多向分化能力方面存在著緊密關聯。

miRNAs首先在細胞核內轉錄成前體轉錄本(primary transcript miRNAs，pri-miRNAs)，在細胞核內Drosha酶的作用下剪切形成60～70個核苷酸的具有發(fā)夾結構的miRNAs前體(pre-miRNAs)，然后由轉運蛋白運輸到細胞質中。隨后，另一個核酸酶Dicer在細胞質中將其剪切產生約為22個核苷酸長度的miRNA:miRNA*雙鏈。這種雙鏈很快被引導進入RNA誘導沉默復合體中，其中一條單鏈miRNAs被降解，另一條即為成熟的單鏈miRNAs分子，它通過與靶基因的3′UTR(非編碼區(qū))區(qū)互補配對，對靶基因miRNAs進行切割或者翻譯抑制(圖1)[3]。

圖1 miRNAs合成示意圖

PolⅡ：RNA聚合酶；Drosha:核糖核酸酶Drosha；Pasha:核糖核酸酶Drosha的輔助因子；Pri-miRNA:初級轉錄本；Pre-miRNA:miRNA前體；Dicer:核糖核酸酶Dicer；Exportin 5/RNA-GTP:核輸出蛋白；Nucleus:細胞核；Cytoplasm:細胞質；unwind:解旋；miRNA/miRNA duplex:雙鏈miRNA；Mature miRNA:成熟miRNA

2 miRNAs的特點

miRNAs作為細胞內具有轉錄后調控作用的非編碼RNA，具有以下特點。①細胞特異性：不同組織、不同細胞的miRNAs的表達譜及序列特征不同，該特點可以作為某些組織或細胞的特異性分子標志；②“時空”特異性：細胞在不同發(fā)育階段miRNAs組成不同，在特定細胞的特定階段“出現”特定的miRNAs，決定細胞的分化方向和分化時相，是細胞定時、定向分化的開關；③保守性：不同種屬、不同組織器官以及不同細胞之間相同或相似的miRNAs分子具有相似的調控功能；④miRNAs作用靶點：多為呈“時空” 特異性表達的轉錄調控基因以及凋亡調控基因，通過調控細胞增殖和細胞凋亡，從而調控細胞功能和結構的特殊化[4-6]。正因為miRNAs具有上述特點，決定了其在干細胞的維持和分化過程中將扮演重要作用。

3 miRNAs在BMSCs三胚層分化中的作用

3.1miRNAs誘導BMSCs分化為成骨細胞 研究人員利用基因芯片檢測miRNAs的表達情況，并通過芯片顯著性分析方法，比對出BMSCs較其誘導分化后的靶細胞，有8個miRNAs(miR-424，34a，593，10a，148a，602，709，665)過表達,其中miR-424在BMSCs自我更新和三胚層分化中起重要的維持和調控作用[7]。另有研究表明，將miR-30a-5p經體外轉染入間充質干細胞(mesenchemal stem cells，MSCs)，并誘導MSCs成骨定向分化，發(fā)現它能在MSCs定向成骨分化的過程中起到促進增強作用[8]。在BMSCs向成骨分化過程中，miR-26a的表達上升約25倍，實驗顯示miR-26a mimics(模擬生物體內源的miRNAs)的轉染可以促進BMSCs的成骨分化潛能。在骨質疏松環(huán)境中，miR-26a表達下降，間接證實了miR-26a對小鼠BMSCs成骨潛能的促進作用[9]。miR-34家族的兩個成員miR-34b和miR-34c，不但可以通過阻礙細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白依賴性激酶激活性激酶4和細胞周期蛋白依賴性激酶激活性激酶6的蛋白積累從而抑制成骨細胞的增殖，而且還能夠通過降低特異AT序列結合蛋白2的蛋白表達抑制成骨細胞的最終分化成熟[10]。miR-125b可抑制ST2間充質干細胞的增殖，并進一步抑制其向成骨細胞分化[11]。

3.2miRNAs誘導BMSCs分化為肝細胞 科學家們尋找到了影響B(tài)MSCs分化為肝細胞的miRNAs。對人BMSCs和向肝細胞特異性分化的huc-BMSCs的全部RNA在不同時段進行搜集數據分析，發(fā)現有25種miRNAs過表達；有36種miRNAs低表達。這些miRNAs表達的變化也在大量反轉錄聚合酶鏈反應中被證實。這些實驗結果說明miRNAs對BMSCs分化為肝細胞發(fā)揮一定的調控作用[12]。

研究顯示，miRNAs通過抑制或促進某些生物因子的表達而對肝細胞增殖發(fā)揮調控作用。研究人員通過對小鼠進行2/3肝切除術后，檢測miRNAs的表達發(fā)現，在細胞周期G1～S的時相轉變過程中，這些小鼠肝細胞中的miRNAs呈現缺失或延擱。其中，miR-21的產生和miR-378的抑制最為顯著[13]。let-7家族成員可能通過抑制肝細胞核因子4A的表達，在干細胞自我維護與更新中充當信號分子[14]。研究人員通過對比受損肝組織與正常肝組織發(fā)現，miR-23a、miR-27a和miR-27b的表達在受損肝組織中顯著降低。基質細胞衍生因子1/趨化因子受體4對誘導干細胞遷移、參與受損肝組織再生中起到決定性作用，通過熒光素酶含量測定及蛋白印跡進一步分析發(fā)現，miR-27b可以通過抑制基質細胞衍生因子1/趨化因子受體4的表達來阻止干細胞的定向遷移[15]。

3.3miRNAs誘導BMSCs分化為神經細胞 研究人員發(fā)現，miR-124在大腦發(fā)育過程中的表達呈上升狀態(tài)。miR-124在中樞神經系統發(fā)育過程中通過抑制C末端小結構域磷酸酶1的表達使BMSCs分化為神經細胞[16]。另一種控制神經干細胞分化的miRNAs是miR-137，miR-137的過表達抑制了細胞增殖而促進了NSCs的分化。miR-137通過抑制麥角酰二乙胺1調節(jié)神經干細胞的分化。另外，miR-137還通過抑制樹突形成來調控神經元的成熟[17]。miR-128也是一種大量存在于腦組織中的神經細胞所特有的miRNAs，在大腦發(fā)育過程中表達升高，促進神經干細胞的分化[18]。構建小鼠miRNAs-9-1慢病毒載體(miRNAs-9-1-LV)并感染小鼠BMSCs，感染miRNAs-9-1-LV后的BMSCs經β-巰基乙醇誘導向神經細胞分化比率增加[19]。有趣的是，BMSCs還可以將miR-133b轉運至神經細胞來調控神經突起的生長。研究發(fā)現，對小鼠大腦中動脈栓塞的MSCs療法使miR-133b在大腦同側半球中的水平顯著升高[20]。在體外，當MSCs暴露于大腦中動脈栓塞的小鼠大腦同側局部缺血組織后，MSCs內外的miR-133b水平提高。同樣，在接受MSCs濃縮成分治療的體外原代培養(yǎng)的神經元細胞和星形細胞中miR-133b的水平升高。對從成體小鼠細胞中分離出的NSPCs(neural stem/progenitor cells)進行原代培養(yǎng)，發(fā)現miR-106b-25基因簇(miR-106b，miR-93和miR-25)的重要性。研究發(fā)現，剔除 miR-25可降低NSPCs的增殖，然而miR-25 的異常表達卻促進了NSPCs的增殖。在NSPCs中完整表達miR-106b-25基因簇也能提高神經干細胞產生新神經細胞的能力[21]。

4 結語和展望

目前，科學家們正在不斷探索如何將BMSCs準確高效地誘導成需要的組織細胞，miRNAs在BMSCs向三胚層分化的研究成果無疑對該課題具有重要的指導作用。同時，研究人員也已開始關注如何將其成果更好的運用到臨床。如丁金勇等[22]所做的BMSCs分化為成骨細胞優(yōu)化生物活性玻璃的實驗研究發(fā)現，具有適宜孔隙率的生物活性玻璃復合材料有望成為培養(yǎng)人工骨的種子支架，為骨組織工程的臨床應用奠定了實驗基礎。有理由相信，miRNAs在BMSCs向三胚層分化的作用機制將會更加清晰，利用miRNAs準確誘導，并控制BMSCs分化為各種組織細胞將為人類健康帶來更大福祉。

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