理氣活血方劑對球囊損傷后實驗性大耳白兔低密度脂蛋白膽固醇及血小板源性生長因子B水平的影響

賞 楠

(遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心內(nèi)VIP科,沈陽 110032)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增生是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)病變的關鍵，是心血管疾病藥物治療的靶細胞之一，所以研究VSMC增生的機制,已經(jīng)成為研究As發(fā)病機制的一個關鍵。血管狹窄的細胞學基礎是血管中膜的平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移并增生轉(zhuǎn)型，引起血管內(nèi)膜增生，因此若能控制VSMC增殖可以實現(xiàn)抑制血管內(nèi)膜增生，從而阻止血管狹窄。血小板源性生長因子-B(platelet-derived growth factor-B,PDGF-B)的表達及低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein -cholesterol，LDL-C)的水平與VSMC增殖密切相關。本研究建立大耳白兔As模型以反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測PDGF的水平及生化方法觀察LDL-C的水平，觀察中藥方劑對引起血管狹窄因素的抑制水平,即中藥方劑抑制LDL-C的水平及PDGF-B的表達，從而驗證中藥方劑對As的抑制水平。

1 材料與方法

1.1實驗材料 動物:選取2～3月齡大耳白兔32只，體質(zhì)量為2.2～2.6 kg，由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。不分雌雄、體質(zhì)量、月齡，隨機分為正常對照組、模型組、西藥組、中藥組四組，每組8只，分籠飼養(yǎng)。高脂飼料:配方(質(zhì)量分數(shù))采用15%蛋黃粉+5%豬油+1%膽固醇+基礎飼料(基礎飼料、蛋黃粉、豬油及膽固醇均購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬二院動物實驗中心)。藥品:理氣活血湯的組成為柴胡25 g、益母草25 g、川芎 25 g、香附25 g、當歸25 g(以上藥物煎煮成30 mL湯藥)。氟伐他汀膠囊，40 mg/粒(北京諾華制藥有限公司,國藥準字：H20010518)。

1.2實驗試劑及器材

1.2.1RT-PCR試劑 RNA提取試劑(Trizol)(invitrogen公司生產(chǎn)，批號：1203406)，異丙醇(寶生物工程大連有限公司生產(chǎn)，批號：0980507)；氯仿(寶生物工程大連有限公司生產(chǎn)，批號：20010401)；焦碳酸二乙酯(DEPC)(寶生物工程大連有限公司生產(chǎn)，批號：BBI0916S03)；DNA-marker DL2000(寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，批號：CB3301)；RT-PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司，批號：BK2201)。

1.2.2儀器和設備 2.5～3.0 mm球囊導管及導絲、PCR儀(PE-9600美國)、離心機(德國Heittich Roto Silenta 600RS)、貝克曼700型全自動生化儀等。

1.3實驗方法 正常對照組給予基礎飼料，西藥組、中藥組、模型組均予以高脂飼料；而西藥組和中藥組則在喂飼高脂飼料的基礎上分別加用氟伐他汀膠囊和理氣活血湯，每日給藥一次(其中氟伐他汀膠囊用量為10 mg/只，將理氣活血湯組成的重要煎煮成30 mL，分三日口服，10 mL/d/只灌胃)用量參照文獻[1]計算。各組動物每日限食100～120 g，自由飲水。實驗第5周，西藥組、中藥組和模型組均行右側(cè)腹-髂動脈內(nèi)膜球囊損傷術(shù)，方法為：右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)股動脈搏動處最明顯處局部麻醉，切開皮膚，逐層分離，暴露并游離股動脈，于股動脈前壁剪開一小口，依次送入導絲針和軟頭導絲，并沿導絲導入球囊導管，以0.09%鹽水擴張球囊壓力，并阻抗力回拉至股動脈，抽空球囊，再插入球囊擴張，如此重復三次，充分剝脫腹髂動脈內(nèi)膜，術(shù)畢取出球囊和導絲，逐層進行縫合，術(shù)后第3日開始每日肌內(nèi)注射慶大霉素8萬U抗感染，創(chuàng)面局部噴散慶大霉素8萬U防止感染，術(shù)區(qū)切口僅2 cm，損傷較小。以上各組試驗時間均為8周，造模后大耳白兔未見明顯異常。實驗第8周，實驗結(jié)束，于耳緣靜脈采血后處死大耳白兔，保留大耳白兔腹主動脈以便進一步觀察動脈變化。將兔血清離心分離，利用貝克曼700型全自動生化儀及LDL-C配套試劑盒以勻相測定法測定LDL-C，用RT-PCR方法觀察PDGF-B的表達。

2 結(jié) 果

2.1LDL-C的變化 模型組的LDL-C水平高于正常組(P<0.05)；中藥組和西藥組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；西藥組、中藥組LDL-C水平均低于模型組(P<0.05)(表1)。

2.2RT-PCR結(jié)果 從色帶的明暗度上可以看出，模型組的PDGF-B的表達較強，色帶較亮，其次為正常組，再次為西藥組，最弱為中藥組(圖1)。模型組表達高于中藥組和西藥組(P<0.05)，而中藥組和西藥組PDGF-B的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表1 四組大耳白兔LDL-C水平的對照

圖1 RT-PCR方法檢測PDGF-B的表達

表2 四組大耳白兔PDGF-B對照 (mg/L)

3 討 論

隨著心血管診療水平的不斷進展，心臟介入手術(shù)被更多的人所接受和認可，怎樣預防介入后再狹窄的問題成了心內(nèi)科醫(yī)師所面臨的新挑戰(zhàn)。本實驗通過球囊損傷血管內(nèi)膜加高脂飲食成功建立了As及再狹窄的實驗模型。近年來血脂異常以及As發(fā)病年齡越來越低，發(fā)病機制呈現(xiàn)出由虛轉(zhuǎn)實的趨勢。肝失疏泄從而導致氣機不暢、氣滯血瘀、瘀血內(nèi)停，成為導致As發(fā)病的又一病機。所以本方采用疏肝理氣，活血化瘀的治療方法，通過現(xiàn)代科學技術(shù)手段，印證理氣活血方劑對As病變的防治效果。本實驗研究結(jié)果顯示,中藥組大耳白兔LDL-C和PDGF-B含量顯著低于模型組，而中藥組和西藥組無明顯差異。以上實驗結(jié)果說明理氣活血中藥方劑與氟伐他汀膠囊具有相對一致的作用，能夠有效降低血脂、減少造成血管內(nèi)皮細胞增生的PDGF-B的表達。

本方中柴胡的有效成分柴胡皂甙具有降低血漿LDL-C和降低兔血壓的作用。有實驗證明，以柴胡為主的大柴胡湯可以改善高脂血癥所致的動脈內(nèi)皮和平滑肌損傷[2]，可抑制血小板聚集，具有甾體和非甾體雙重抑制作用，抑制前列腺H2的合成[3]；同時可以減少As模型主動脈內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊面積及斑塊厚度，顯著減輕VSMC的增生。當歸中所含的阿魏酸及多糖成分是被較早提取出來的當歸有效成分，明顯改善血脂，降低LDL-C，升高高密度脂蛋白膽固醇、超氧化物歧化酶水平,顯著降低大鼠主動脈組織中血管細胞黏附分子信使RNA的表達,提示當歸可能有保護血管內(nèi)皮細胞功能的作用,可以抑制As的發(fā)生、發(fā)展[4]。現(xiàn)代藥理證明[5-8]，益母草的主要成分為益母草堿，水蘇堿，益母草啶等成分，具有溶栓、抗凝、降脂、抗炎、改善微循環(huán)等作用。四甲基吡嗪為川芎的主要成分,為行氣活血化瘀的一種中藥生物活性堿,它可以增加冠狀動脈血流量、降低冠狀動脈阻力和降低血管外周阻力的作用[9]。

PDGF-B表達的增加，可以促使VSMC的增殖和下調(diào)VSMC的細胞分化，同時誘導間質(zhì)細胞的一系列免疫反應[10]。PDGF-B在As的形成中發(fā)揮更加主要的作用，通過抑制LDL-C的受體相關蛋白6增強VSMC增殖[11]，通過蛋白酪氨酸磷酸酶減少PDGF-B磷酸化的水平來抑制VSMC的增殖和遷移，或通過異常的促炎癥高密度脂蛋白作用在單核細胞上PDGF-B信號通路部分推進促As表型的研究，都從不同角度證實了PDGF在As中的作用。因此有效控制PDGF基因表達可以阻止VSMC的增殖。本實驗建立實驗大耳白兔高脂及腹主動脈損傷模型，同時以中藥湯劑灌胃后，證明理氣活血方能夠抑制PDGF的表達，降低血脂，改善血管內(nèi)皮細胞的增殖和轉(zhuǎn)型，控制血管增生，從而控制血管狹窄。本實驗結(jié)果顯示中藥組PDGF-B的表達低于模型組，說明該湯藥方劑有可能抑制VSMC增殖，從而阻止內(nèi)膜增生，達到控制血管狹窄發(fā)生發(fā)展的目的。

[1] 郎曉謳,曾克.32P局部照射對移植靜脈內(nèi)膜平滑肌細胞增殖與凋亡的影響等[J].中華外科雜志,2002,40(2):133-135.

[2] 鄭嫻,王鳳榮.大柴胡湯對動脈粥樣硬化家兔及炎性因子的表達[J].遼寧中醫(yī)雜志,2013,54(19):1681-1682.

[3] 鄒建華.小柴胡湯和大柴胡湯對膠原誘發(fā)血小板聚集和前列腺素合成的抑制作用[J].國外醫(yī)學中醫(yī)中藥分冊,1987,9(1):21-23.

[4] 閻艷麗,吉梅,宋曉宇,等.當歸芍藥散對血脂異常大鼠抗氧化能力及動脈壁血管細胞粘附分子-1基因表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2007,13(2):25-28.

[5] Liu XH,Pan LL,Zhu YZ.Active chemical compounds of traditional Chinese medicine Herba Leonuri:implications for cardiovascular diseases[J].Clin Exp Pharmacol P,2012,39(3):274-282.

[6] Wojtyniak K,Szymanski M,Matlawska I.Leonurus cardiaca L.(Motherwort):a review of its phytochemistry and pharmacology[J].Pytother Res,2012,27(8):1115-1120.

[7] 范靜婧，朱瑋瑋，王婧薷，等.益母草對家兔離體小腸平滑肌的作用及其作用機制研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2012,23(4):837-838.

[8] 王偉平，雷慧，候亞莉，等.益母草注射液提升彌散性血管內(nèi)凝血模型大鼠的平均動脈血壓[J].時珍國醫(yī)國藥，2011,22(1):121-122.

[9] 張學鋒,劉艷凱,牛春雨,等.川芎嗪對血瘀大鼠腸系膜淋巴微循環(huán)的影響[J].微循環(huán)學雜志,2004,14(2):8-9.

[10] Olson LE,Soriano P.PDGFRb signaling regulates mural cell plasticity and inhibits fat development[J].Dev Cell,2011,20(6):815-826.

[11] Keramati AR,Singh R,Lin A,etal.Wild-type LRP6 inhibits,whereas atherosclerosis-linked LRP6R611C increases PDGF-dependent vascular smooth muscle cell proliferation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(5):1914-1918.