慢性胃炎模型建立方法及其檢測指標概述

楊金娜，李欣欣(綜述)，馬曉慧，張予陽(審校)

(1.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，沈陽 110016； 2.天津天士力研究院，天津 300410)

慢性胃炎是多種因素引起的胃黏膜慢性炎性病變，其首要致病因素是幽門螺桿菌感染，其他致病因素包括細菌在胃內(nèi)過度增殖、自身免疫、藥物(如長時間服用非甾體類消炎藥)、膽汁反流、吸煙、飲酒等[1-3]。2011年，由中華醫(yī)學會消化內(nèi)鏡學分會調(diào)查結(jié)果顯示，在各型慢性胃炎中，慢性非萎縮性胃炎(chronic non-atrophy gastritis,CNAG)最為常見(59.3%)，其次為慢性非萎縮性或萎縮性胃炎伴糜爛(49.4%)，慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)比例高達23.2%(但多為輕度)[4]。慢性胃炎對人們的生活質(zhì)量產(chǎn)生了重要影響，慢性胃炎的研究是胃病研究的重要課題之一。穩(wěn)定、可靠的動物模型的復制及其相關(guān)檢查指標的檢測是慢性胃炎相關(guān)基礎(chǔ)與臨床研究的重要基礎(chǔ)。之前有對慢性胃炎動物模型的綜述文章，但是何種模型最接近人類慢性胃炎的發(fā)生機制，并沒有推薦[5]。且慢性胃炎模型造模時間較長，一般為10～24周，找到一種更快速、穩(wěn)定、可靠的理想模型，成為廣大實驗者的迫切需求。

1 慢性胃炎動物模型的復制

1.1CNAG CNAG是指胃黏膜不伴有萎縮性改變，胃黏膜層、淋巴細胞和漿細胞為主的慢性炎性細胞浸潤的慢性胃炎。臨床檢驗時表現(xiàn)為內(nèi)鏡下可見黏膜紅斑、黏膜出血點或斑塊、黏膜粗糙伴或不伴水腫、充血滲出等。CNAG是一種臨床常見病，非萎縮性胃炎遷延不愈將轉(zhuǎn)化為萎縮性胃炎，另外CNAG患者中約10%在20年觀察中發(fā)展為胃癌。因此建立人類類似的CNAG動物模型，對非萎縮性胃炎的深入研究，預(yù)防萎縮性胃炎和胃癌具有重要意義。

應(yīng)用大鼠造模，分為灌胃、自由飲用和饑飽失常3個步驟[6]:①灌胃，包括乙醇和脫氧膽酸鈉兩種。乙醇每周2次灌胃；脫氧膽酸鈉每日灌胃。②自由飲用，氨水配成兩個濃度，在不同時間段分別給予。即在第1～6周給予0.05%的氨水，第7～12周給予0.1%氨水。③饑飽失常，單日禁食，雙日足量喂食。三個步驟共同操作，12周后可成功建立SD大鼠慢性淺表性胃炎模型，且穩(wěn)定性良好。也可采用自由飲用合并饑飽失常法，即步驟2和步驟3聯(lián)用，16周后也可以成功建立大鼠慢性淺表性胃炎模型[7-8]。

1.2CAG CAG是指已經(jīng)出現(xiàn)胃固有腺體減少的慢性胃炎，常常伴有腸上皮化生?？梢苑譃槎嘣钗s性胃炎、自身免疫性胃炎。內(nèi)鏡表現(xiàn)為蒼白或灰白、紅白相間(以白為主)，黏液糊縮小或干枯，黏膜薄可見血管。CAG是中老年人多發(fā)疾病，目前該病的發(fā)生率有逐年上升的趨勢。CAG是一個慢性過程，其發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，如酒精刺激、飲食過咸過燙，饑飽失常、膽汁反流等。建立類似人類慢性萎縮性胃炎動物模型對探討該病發(fā)生機制及其預(yù)防治療藥物研究具有重要意義，目前主要有生物造模法、化學損傷法及主動免疫法3種。

1.2.1生物造模法 幽門螺桿菌感染患者中，CAG的發(fā)生率較非萎縮性胃炎高[9]。在CAG患者中，幽門螺桿菌感染陽性患者高于感染陰性患者。Meta分析結(jié)果顯示，幽門螺桿菌感染和CAG發(fā)生率之間的比率為5(95%CI3.1～8.3)，說明幽門螺桿菌感染者發(fā)生CAG的可能性是未感染者的5倍[10]。由于幽門螺桿菌在胃部長期定植困難，現(xiàn)階段尚缺乏成功的動物感染模型。大鼠是目前常用的實驗動物，但在無胃黏膜損傷情況下，大鼠很難被幽門螺桿菌感染，故很多實驗須首先造成大鼠胃黏膜輕微損傷，然后再使之感染幽門螺桿菌。

選用Wistar大鼠，采取N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)+幽門螺桿菌綜合方法制作CAG模型，分3個程序[11]:①自由飲用，供大鼠自由飲用MNNG，24 h更換一次，持續(xù)8周。②感染幽門螺桿菌，以消炎痛一次性皮下注射，隔日灌胃給予培養(yǎng)好的幽門螺桿菌菌株，共5次10 d。灌胃前后分別禁食12 h。③自由飲用，間隔2周后，再次自由飲用MNNG溶液。三個程序依次進行，12周后成功建立CAG動物模型。

1.2.2化學損傷法 乙醇聯(lián)合脫氧膽酸鈉法能夠成功建立大鼠慢性胃炎模型，此模型病變特點與人類的慢性胃炎甚為相似，而且方法簡便可靠、經(jīng)濟、重復性好，是一種進行慢性胃炎病因?qū)W、發(fā)病學及實驗治療學研究的較為理想模型。其造模機制為乙醇可以被胃直接吸收，在細胞醇脫氫酶的催化下產(chǎn)生乙醛；乙醛是一種強氧化劑，刺激胃黏膜可以導致慢性胃炎病理變化，同時灌胃脫氧膽酸鈉來模擬人體膽汁酸反流，也能加速產(chǎn)生慢性胃炎病變。用65%乙醇+脫氧膽酸鈉溶(自由飲用)，經(jīng)12周成功建立大鼠慢性胃炎模型[12]?；蛘哂?0%酒精(灌胃)+脫氧膽酸鈉(灌胃)+氨水(自由飲用)+吲哚美辛+饑飽失常綜合法，經(jīng)16周也可成功復制慢性萎縮性胃炎大鼠模型[13]。

其他實驗研究發(fā)現(xiàn)，可以單獨用55 ℃鹽水灌胃10周后建立大鼠模型[14]；或者單獨用55 ℃蒸餾水灌胃(2.5 mL/d) 24周后建立大鼠萎縮性胃炎動物模型[15]；還可以單獨用氨水自由飲用，連續(xù)12周造模完成[16]；也可以將MNNG+水楊酸鈉+熱鹽水+饑飽失常4個因素合并制作萎縮性胃炎大鼠模型[17]。

Rodrígue等[18]采用BALb/c雄性小鼠，單籠喂養(yǎng)，每日自由飲用乙酰水楊酸溶液，10 d后也可成功造成慢性胃炎模型，這是目前報道中成模時間最短的一種造模方法，但其可重復性和模型穩(wěn)定性需要更多數(shù)據(jù)進行支持。

1.2.3主動免疫法 CAG患者血中常可以檢測到兩種抗體，即壁細胞抗體和內(nèi)因子抗體。壁細胞抗體是針對壁細胞微管膜上H+-K+-ATP酶的抗體，與壁細胞抗原結(jié)合形成抗原抗體復合物，在補體的參與下，破壞壁細胞，形成慢性胃炎。細胞免疫在CAG特別是伴惡性貧血患者的發(fā)病機制中也起到重要作用。目前研究者采用主動免疫法建立CAG模型，實驗采用 Wistar大鼠，皮下注射佐劑抗原，3周后重復注射1次，饑飽失常，6周模型復制成功[19]。

2 檢測指標

目前慢性胃炎模型復制成功與否的判斷主要根據(jù)病理組織學檢查，胃組織形態(tài)的觀察結(jié)果作為輔助。新的可視化技術(shù)還可對胃黏膜損傷面積進行評價，進而清晰地顯示出胃黏膜受損情況。此外，胃蛋白酶、胃泌素、胃酸、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、一氧化氮等機制相關(guān)檢測指標也被大量研究者監(jiān)測，為慢性胃炎的發(fā)病機制研究提供幫助。下面將介紹慢性胃炎實驗研究中常用的檢測指標。

2.1模型成功判斷性指標

2.1.1胃組織形態(tài)直接觀察 觀察指標包括胃部大小、胃壁厚度、皺襞數(shù)量、黏膜色澤及出血等大體情況。正常組大鼠胃黏膜呈淺紅色，表面光滑，附著許多黏液，全層胃壁較厚，皺襞規(guī)則，富有彈性。模型組大鼠黏膜色蒼白，胃壁彈性較差，皺襞平坦或走向紊亂，黏膜層變薄，附著少量黏液，部分大鼠胃黏膜會出現(xiàn)出血點。

2.1.2病理組織學檢測 2013中國慢性胃炎共識意見指出，慢性胃炎觀察內(nèi)容包括5項組織學變化和4個分級(圖1)[4]。5項組織學變化包括幽門螺桿菌感染、慢性炎癥(單個核細胞浸潤)、活動性(中性粒細胞浸潤)、萎縮(固有腺體減少)、腸化生(腸上皮化生)。4級包括0：無炎癥；+：在胃黏膜上皮內(nèi)(胃小凹區(qū)) 或固有腺底部可見多個慢性炎細胞；++：在胃黏膜小凹區(qū)至黏膜肌層均有較多炎性細胞浸潤；+++：胃黏膜內(nèi)可見成堆炎細胞聚集灶。并用測微器測量胃竇固有腺厚度和固有腺層切面面積[1,12,20]。

慢性萎縮性胃炎造模成功判斷標準為光學顯微鏡顯示，胃黏膜全層明顯變薄，局灶上脫落糜爛，黏膜固有腺體數(shù)量明顯減少，排列稀疏紊亂，腺體體積縮小，個別呈囊狀擴張，黏膜固有層淋巴細胞浸潤，部分有淋巴濾泡形成[21]。

2.2胃黏膜損傷評價 幽門下結(jié)扎，由食管向胃腔注入緩沖鹽溶液，食管結(jié)扎，取胃固定。15 min后沿胃大彎剪開暴露胃腔，用Image-Pro Plus軟件分析胃內(nèi)表面損傷面積，計算黏膜損傷率[7]。

圖1 慢性胃炎的病理診斷標準(直觀模擬評分法)

2.3慢性胃炎其他調(diào)控因子

2.3.1炎性因子 Toll樣受體4是介導天然免疫與炎性反應(yīng)的模式識別受體，可識別外源性、內(nèi)源性配體，經(jīng)髓樣分化因子88依賴和非髓樣分化因子88依賴信號轉(zhuǎn)導途徑，激活核因子κB，引起各種炎性因子釋放，誘發(fā)炎性反應(yīng)[22]。還可以通過測定白細胞介素2、白細胞介素10、干擾素γ、腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β等炎性相關(guān)因子來研究胃炎炎癥的發(fā)生、發(fā)展。

2.3.2胃部分泌物 游離酸、總酸、胃蛋白酶、胃泌素與胃酸分泌息息相關(guān)，因此用來研究胃酸分泌相關(guān)機制。而通過測定游離黏液量來研究黏液HCO3-鹽相關(guān)機制。

2.3.3其他調(diào)控因子 一氧化氮是由精氨酸轉(zhuǎn)化而來，可調(diào)節(jié)淋巴細胞機制，通過炎性反應(yīng)，可刺激內(nèi)皮型一氧化氮合酶，合成釋放一氧化氮，使毛細血管擴張，通透性增強，可使組織受到損傷。通過測定一氧化氮及一氧化氮合酶的水平可以研究胃黏膜損傷情況，同時可以測定血流量的變化。

超氧化物歧化酶是一種重要的抗氧化酶，可以清除自由基，從而保護生物體免受自由基的攻擊，是胃黏膜的保護因子之一；丙二醛是胃黏膜的攻擊因子之一。因而丙二醛的測定常常與超氧化物歧化酶的測定相互配合，在胃黏膜損傷過程中，超氧化物歧化酶的活性降低，丙二醛的水平升高。因此，可以通過測定超氧化物歧化酶和MDA來研究胃黏膜細胞損傷情況。

Bcl-xL是Bcl-2家族蛋白，可以與其他促凋亡蛋白形成異源二聚體而抑制細胞凋亡，亦可與凋亡蛋白酶活化因子作用或抑制線粒體胱天蛋白酶激活物細胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。Bax是Bcl-2R的同源基因，由p53直接激活，可提高凋亡敏感性，促進p53介導的細胞凋亡。Bcl-xL和Bcl的表達狀況可反映細胞的凋亡狀態(tài)。因此，通過檢測Bcl-xL和Bax的表達來研究細胞凋亡相關(guān)機制[12]。

慢性胃炎中通過檢測EGF及其受體來研究胃黏膜損傷后的修復情況[23]。慢性炎癥刺激破壞胃黏膜后，出現(xiàn)反應(yīng)性EGF升高，進而促進黏膜細胞增殖與修復。EGF受體具有酪氨酸激酶活性，對EGF具有高親和力，并具有特異性。而受體酪氨酸激酶的活性大小主要受EGF水平的影響，因此檢測EGF及其受體的變化能夠研究胃黏膜損傷修復相關(guān)機制。

3 小 結(jié)

慢性胃炎模型采用了許多與人類近似的病因、發(fā)病機制以及病證結(jié)合的方法進行復制，但與人類的實際發(fā)病因素比較還是有一定的差距，每一種模型都具有各自的特點，反映了不同致病因子的作用特點，因此如何選擇合適的模型復制方法，應(yīng)根據(jù)研究的具體內(nèi)容進行設(shè)計。但是目前慢性胃炎實驗研究還處于探索階段，造模時間長，耗費大量人力、物力和時間，在機制研究上也未見重大突破，病理檢測是其目前唯一的金標準。該文希望能夠從模型建立和指標檢測兩個方面為實驗工作者提供文獻參考方面的幫助，選擇合適的動物模型，盡量縮減實驗時間，并進行較為全面的指標檢測。

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