凍融優(yōu)質(zhì)胚胎體外培養(yǎng)時間對臨床結(jié)局的影響

乜照燕 甄秀麗 張 娜 趙素英 郭麗娜 呂翠婷

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（石家莊，050041）

胚胎的冷凍與復(fù)蘇是輔助生殖技術(shù)（ART）中不可缺少的重要組成部分，影響凍融胚胎移植（FET）臨床妊娠的因素較多，包括患者年齡、冷凍胚胎質(zhì)量、內(nèi)膜準備方式等，胚胎復(fù)蘇后和培養(yǎng)時間也是影響因素之一，通常胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)2～3h即進行移植，隨著商品化序貫培養(yǎng)試劑和培養(yǎng)條件的不斷改進，延長胚胎體外培養(yǎng)時間成為可能，延長凍融胚胎復(fù)蘇后體外培養(yǎng)時間是否有助于改善妊娠結(jié)局尚有爭議。本研究對冷凍胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)2～4 h移植、＞4～8h移植、＞8h移植的臨床結(jié)局進行分析，旨在探討冷凍胚胎復(fù)蘇后不同體外培養(yǎng)時間對FET周期臨床結(jié)局的影響。

1 資料和方法

1.1 對象及分組

回顧性分析2011年1月～2012年12月在本院生殖中心進行FET的1061例患者臨床資料。納入標準：移植的胚胎均為新鮮周期獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后復(fù)蘇的優(yōu)質(zhì)胚胎（卵裂球≥6個，碎片≤20%，卵裂球大小均勻），子宮內(nèi)膜厚度8～14 mm。排除標準：存在子宮或盆腔因素者，如子宮腺肌病、黏膜下肌瘤、宮腔粘連、宮腔積液、子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜增生過長，以及盆腔結(jié)核等明確影響子宮內(nèi)環(huán)境因素者。1061例患者中96例冷凍胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)2～4h移植為A組，615例培養(yǎng)＞4～8h移植為B組，350例培養(yǎng)＞8h移植為C組。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)膜準備 月經(jīng)周期正常、有規(guī)律排卵的患者采用自然周期，于月經(jīng)第10天超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育，當(dāng)卵泡發(fā)育成熟（卵泡平均直徑≥17mm）、尿黃體生成素（LH）陽性時，肌注人絨毛膜促性腺激素（hCG ）10 000U，每天超聲監(jiān)測排卵情況，排卵后給予黃體支持，3d后復(fù)蘇胚胎。排卵不規(guī)律、無排卵、月經(jīng)不規(guī)則或多囊卵巢綜合征（PCOS）患者用激素替代周期或者來曲唑誘導(dǎo)排卵周期，激素替代者口服戊酸雌二醇 （補佳樂2～8mg／d），內(nèi)膜厚度≥8mm時，加用孕激素（肌注黃體酮40～60mg／d），3d后復(fù)蘇胚胎；來曲唑誘導(dǎo)排卵周期，當(dāng)卵泡發(fā)育成熟（卵泡平均直徑≥17mm）時，尿LH陽性，肌注hCG 10 000U，每天超聲監(jiān)測排卵情況，排卵后給予黃體支持，3d后復(fù)蘇胚胎。

1.2.2 胚胎冷凍和復(fù)蘇 自制封閉式冷凍套管［1，2］，用眼科剪在0.25ml麥管的前端剪出一個斜面，75%乙醇消毒后備用。在室溫下，將胚胎移至含7.5%乙二醇、7.5%二甲亞砜、10mg／ml人血清白蛋白（HSA）的人輸卵管液（HTF）中平衡5min，最后于含15%乙二醇、15%二甲亞砜、0.6mol／L蔗糖、10mg／ml聚蔗糖（Ficoll）、10mg／ml HSA的HTF中快速清洗至少10次，在體視鏡下迅速將胚胎移至已經(jīng)剪好的0.25ml麥管斜面上。將0.25 ml麥管裝于0.5ml麥管內(nèi)，立即置入液氮并封閉0.5ml麥管，置液氮中保存。胚胎與玻璃化冷凍保護液接觸的總時間控制在60s內(nèi)。

胚胎復(fù)蘇時從液氮中取出冷凍麥管，從外套管內(nèi)取出裝有胚胎的0.25ml麥管，快速將其從液氮中轉(zhuǎn)移到37℃預(yù)熱1h的含1.0mol／L蔗糖、10 mg／ml HSA的 HTF中1min，后移至含0.5mol／L蔗糖、0.25mol／L蔗糖溶液中，分別停留3min，最后在含10mg／ml HSA的HTF中平衡5min，移入胚胎培養(yǎng)液并置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，移植前均行激光輔助孵化。胚胎解凍后完整卵裂球≥50%定義為存活胚胎。胚胎復(fù)蘇率＝存活胚胎／解凍胚胎×100%。

1.2.3 妊娠判定 移植后常規(guī)黃體支持，14d測定血清 －h(huán)CG＞10U／L為生化妊娠，2周后行陰道超聲檢查，提示宮內(nèi)有孕囊者判定為臨床妊娠，3個月后B超隨訪無胎心搏動者為早期流產(chǎn)。胚胎植入率＝（孕囊數(shù)／移植胚胎數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0軟件，計數(shù)資料采用卡方檢驗，多樣本率兩兩比較的卡方分割法，計量資料采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

3組在女方年齡、不孕年限、體重指數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度、胚胎復(fù)蘇率、移植胚胎數(shù)等方面無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 3組患者基本情況比較

2.2 臨床結(jié)局

3組患者的胚胎植入率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

表2 冷凍胚胎復(fù)蘇后不同培養(yǎng)時間臨床結(jié)局比較（%）

3 討論

隨著ART的發(fā)展，胚胎冷凍廣泛應(yīng)用并成為IVF－ET常規(guī)技術(shù)之一。玻璃化冷凍技術(shù)是一種快速冷凍細胞或組織的方法，可避免凍融過程中細胞內(nèi)冰晶形成，最大限度地降低細胞損傷，具有簡單、快捷、冷凍效率高等特點。但冷凍胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)時間至今尚無共識，不同實驗室胚胎培養(yǎng)時間不同，這些差異是否會導(dǎo)致妊娠結(jié)局的不同是本研究的目的。

胚胎復(fù)蘇后通常在體外培養(yǎng)2～3h即行移植。隨著胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展與成熟，胚胎可在體外培養(yǎng)到第5天至囊胚期。將凍融胚胎培養(yǎng)過夜至次日再進行胚胎移植，可從卵裂球是否分裂進一步了解復(fù)蘇后胚胎發(fā)育潛能，從而為FET周期挑選較高植入潛能和發(fā)育潛能的胚胎提供參考。有學(xué)者認為：冷凍胚胎復(fù)蘇后延長體外培養(yǎng)時間可以更好地觀察胚胎的發(fā)育潛能，改善臨床結(jié)局［3－4］。有研究顯示，次日移植并不能提高臨床妊娠率和種植率，反而增加流產(chǎn)率［5］。研究結(jié)果不盡相同，可能與樣本量、患者納入標準及冷凍胚胎選擇標準等有關(guān)。另外，也可能與移植時機的選擇，即對子宮內(nèi)膜種植窗與胚胎發(fā)育同步性的評估有關(guān)。有研究表明，良好的種植環(huán)境是胚胎種植成功及臨床妊娠的關(guān)鍵，子宮內(nèi)膜太厚或太薄都可影響胚胎的著床［6］。許多因素影響FET的成功，包括胚胎冷凍時女方的年齡、不孕原因、移植時雌激素水平、子宮內(nèi)膜厚度、凍存前胚胎形態(tài)及胚胎復(fù)蘇存活率等［7－8］。

本研究選取的對象為近兩年在本中心行FET的1061例患者，年齡均＜37歲，排除盆腔手術(shù)史，移植的胚胎均為經(jīng)玻璃化冷凍后復(fù)蘇的優(yōu)質(zhì)胚胎。研究結(jié)果顯示復(fù)蘇后胚胎培養(yǎng)不同時間組的胚胎植入率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率組間均無統(tǒng)計學(xué)差異，提示體外延長凍融胚胎培養(yǎng)時間并沒有提高FET周期的胚胎植入率和臨床妊娠率。冷凍胚胎質(zhì)量直接影響臨床結(jié)局，本研究移植的凍融胚胎均為優(yōu)質(zhì)胚胎，排除了胚胎質(zhì)量對臨床結(jié)局的影響。

綜上，對于復(fù)蘇的優(yōu)質(zhì)胚胎，延長胚胎體外培養(yǎng)時間并沒有提高FET周期的植入率和臨床妊娠率。對于復(fù)蘇的非優(yōu)質(zhì)胚胎，通過延長體外培養(yǎng)胚胎的時間，判斷、選擇最具有發(fā)育潛能的胚胎進行移植，是否能提高臨床妊娠率尚需進一步研究。

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