p－Akt、p－FoxO1在尋常型銀屑病皮損中的表達

黃莉寧 薛汝增 羅光浦 陳勇軍 曲永彬 吳鐵強 林爾藝 陳永鋒

·短篇論著·

p－Akt、p－FoxO1在尋常型銀屑病皮損中的表達

黃莉寧 薛汝增 羅光浦 陳勇軍 曲永彬 吳鐵強 林爾藝 陳永鋒?

目的: 檢測p－Akt和p－FoxO1蛋白在尋常型銀屑病皮損中的表達。方法: 收集30例尋常型銀屑病患者的皮損及30名健康對照皮膚組織,采用Western blot法檢測p－Akt和p－FoxO1的表達。結果: 與正常皮膚組相比,尋常型銀屑病皮損中p－Akt和p－FoxO1的表達水平明顯上調(diào),兩組具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。結論: Akt和FoxO1可能與銀屑病皮損中角質(zhì)形成細胞的異常增殖有關。

尋常型銀屑病； FoxO1； Akt； 蛋白印跡法

尋常型銀屑病是一種紅斑鱗屑性疾病,其發(fā)病率高、難治愈、易復發(fā),嚴重影響患者的身心健康。目前認為本病是遺傳因素與環(huán)境因素等多種因素相互作用的多基因遺傳病,通過免疫介導的共同信號通路引起角質(zhì)形成細胞過度增殖。1組織病理具有角質(zhì)形成細胞過度增殖和真皮乳頭血管新生且迂曲擴張等特點。2目前引起角質(zhì)形成細胞過度增殖的機制尚未闡明。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase, PI3K)/Akt信號轉導通路是細胞存活的重要通路,參與細胞生長、細胞增殖等多個過程。FoxO1作為其下游的效應靶蛋白,在細胞生長、細胞增殖中亦發(fā)揮重要作用。本研究對尋常型銀屑病皮損中Akt及其下游效應靶蛋白FoxO1的磷酸化水平進行檢測,探討其在銀屑病發(fā)病過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集本院2012年門診和住院的尋常型銀屑病患者30例,其中男15例、女15例,年齡16～54歲,平均36.2歲,病史0.5個月至27年,所有病例均具有典型皮損并經(jīng)組織病理診斷,本次發(fā)病以來均未經(jīng)任何治療。健康對照組30例,來自我院皮膚外科手術多余的正常皮膚或手術環(huán)切的包皮。取材后,將標本立即置于液氮中冷凍保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過并與患者簽署知情同意書。

1.2 試劑 p－Akt1/2/3(Ser473)、β－actin多克隆抗體均購于美國Santa Cruz公司,p－FoxO1(S256)多克隆抗體購于美國Abcom公司,AP標記的山羊抗兔多克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術公司,10%SDS－PAGE預制膠購于上海生工生物工程公司,聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購于美國PALL公司,BCA法蛋白定量試劑盒、RIPA蛋白裂解液、ECL顯色試劑盒、Tris－甘氨酸電泳緩沖液、半干轉膜液及其它試劑購于江蘇碧云天生物技術公司。

1.3 Western blot檢測 從液氮中取出凍存的標本,用眼科剪將組織剪切成細小的碎片并用組織勻漿器勻漿,RIPA細胞裂解液(內(nèi)含PMSF)冰上裂解細胞, BCA法測定蛋白濃度,取50 μg總蛋白變性后進行SDS－PAGE恒壓電泳,半干法將電泳產(chǎn)物轉移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉4℃封閉2 h,滴加一抗(1∶1000),4℃過夜,TBST洗膜4次,每次10 min,滴加二抗(1∶5000),37℃孵育2 h,TBST洗膜4次,每次10 min,按ECL試劑盒說明進行顯色,在自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)下自動成像,分析目的蛋白條帶的平均灰度值,以β－actin蛋白作為內(nèi)參,以目的蛋白與β－actin的灰度比值作為目的蛋白的相對含量,進行統(tǒng)計學分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析,每兩組相對灰度值之間的比較采用t檢驗,P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

尋常型銀屑病皮損中p－Akt及p－FoxO1的相對灰度值為1.02±0.27和1.83±0.61,與健康對照組0.55 ±0.09和0.69±0.12相比,具有顯著統(tǒng)計學差異(t＝5.41,P＜0.05)。結果見圖1、2。

圖1 兩組灰度值電泳圖

圖2 兩組灰度值比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),尋常型銀屑病皮損組織中角質(zhì)形成細胞的增生速度是正常表皮的2倍,而其細胞周期縮短了8倍(36 h比311 h),每日生成的角質(zhì)形成細胞數(shù)量高出正常表皮的28倍。3角質(zhì)形成細胞良性過度增殖是尋常型銀屑病的病理特征之一,而對其過度增殖的機制目前仍未完全闡明。李政霄等4發(fā)現(xiàn)上皮鈣黏素和β連環(huán)蛋白表達下調(diào)可能與銀屑病角質(zhì)形成細胞高度增殖有關；劉厚君等5發(fā)現(xiàn)細胞周期蛋白A、D1、B1和E可能通過誘導細胞增殖參與了銀屑病的發(fā)病。但這些研究僅局限于下游效應分子的表達,對于上游信號傳導的調(diào)控未闡明。為此,本研究將PI3K/Akt信號通路及下游FoxO1蛋白作為研究靶點,進一步闡明其可能的發(fā)病機制。

PI3K/Akt信號通路是細胞內(nèi)一條調(diào)控細胞增殖的重要通路,Akt是PI3K下游直接的靶蛋白,屬于一種癌基因,因其與蛋白激酶A和C有高度同源性,又被命名為蛋白激酶B(簡稱PKB)。6Akt是PI3K信號通路關鍵的分子,通過磷酸化其下游糖原合成酶激酶－3、Bad(Bcl－2家族成員)、FoxO家族等蛋白來調(diào)控細胞的增殖與凋亡。7,8本研究發(fā)現(xiàn),銀屑病皮損中p－ Akt的表達水平明顯上調(diào),這與張曉艷等9的研究結果一致。既往研究銀屑病中PI3K/Akt信號下游轉導通路局限于Bad及mROT,形成PI3K/Akt/mROT通路,10而對于Fox蛋白家族的表達情況,研究較少。

Fox蛋白(forkhead box)是脊椎動物叉頭樣轉錄因子的總稱,2000年正式統(tǒng)一命名,是一個具有多種功能的轉錄因子大家族,通常和細胞生長發(fā)育的調(diào)控有關。11該家族的共同特征是具有一個長110個氨基酸的DNA結合結構域,稱為Fox結構域,折疊成3個α螺旋和2個翅膀狀(winged)的大環(huán)結構。至今已經(jīng)定義了17類Fox蛋白,即FoxA～Q,目前研究最多的是FoxO亞家族。12FoxO在進化上高度保守,氨基酸序列中含有3個Akt磷酸化基序,是胰島素/胰島素樣生長因子信號通路中的關鍵因子,其上游受PI3K/Akt磷酸化級聯(lián)通路的調(diào)節(jié),下游靶基因則與細胞增殖、分化、代謝、凋亡及基因表達密切相關。13FoxO1作為FoxO家族的重要亞成員之一,主要在脂肪組織高表達,在生長因子或胰島素刺激下,通過Akt依賴的Thr32、Ser253和Ser315三個特殊位點的磷酸化而受到調(diào)控。這種Akt依賴的磷酸化發(fā)生后,改變FoxO1蛋白的亞細胞定位,使其從細胞核向胞漿轉移,失去轉錄因子的活性,減少其下游靶基因的合成,從而失去對細胞增殖的抑制,導致細胞的過度增殖。

由此推測,銀屑病皮損內(nèi)的炎癥因子激活PI3K,進一步活化Akt,磷酸化的Akt導致下游的FoxO1磷酸化水平升高,使其從細胞核向胞漿轉移,失去轉錄因子的活性,導致下游效應分子的表達異常,使得角質(zhì)形成細胞出現(xiàn)過度增殖。本研究結果顯示尋常型銀屑病皮損中Akt、FoxO1的磷酸化水平增高,證實了該推論。

1張學軍.皮膚性病學.7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008.141－144.

2朱學駿,涂平.皮膚病的組織病理診斷.2版.北京:北京大學醫(yī)學出版社,2001.65－67.

3鄭敏.銀屑病發(fā)病機制研究中若干問題的思考.中華皮膚科雜志,2006,39(3):121－123.

4李政霄,紀泛撲,彭振輝,等.上皮鈣粘素、β－連環(huán)蛋白、細胞周期素D1在進行期尋常型銀屑病皮損的表達.南方醫(yī)科大學學報,2008,28(4):545－547.

5劉厚君,吳艷,林能興,等.尋常型銀屑病皮損中細胞周期蛋白A、D1、B1和E的表達.中國麻風皮膚病雜志,2007,23 (2):98－100.

6 Vandermoere F,El YI,Adriaenssens E,et al.The antiapoptotic effect of fibroblast growth factor－2 is mediated through nuclear factor－kappaB activation induced via interaction between Akt and IkappaB kinase－beta in breast cancer cells.Oncogene, 2005,24(35):5482－5491.

7 Fatrai S,Elghazi L,Balcazar N,et al.Akt induces beta－cell proliferation by regulating cyclin D1,cyclin D2,and p21 levels and cyclin－dependent kinase－4 activity.Diabetes,2006,55 (2):318－325.

8 Parcellier A,Tintignac LA,Zhuravleva E,et al.PKB and the mitochondria:AKTing on apoptosis.Cell Signal,2008,20(1): 21－30.

9張曉艷,周平,尤立平,等.銀屑病皮損表皮內(nèi)Akt的激酶活性增強.中華皮膚科雜志,2009,42(6):413－416.

10 Chen L,Wu J,Pier E,et al.mTORC2－PKBalpha/Akt1 Serine 473 phosphorylation axis is essential for regulation of FOXP3 stability by chemokine CCL3 in psoriasis.J Invest Dermatol,2013,133(2):418－428.

11 Kaestner KH,Knochel W,Martinez DE.Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors.Genes Dev, 2000,14(2):142－146.

12 Huang H,Tindall DJ.Dynamic FoxO transcription factors.J Cell Sci,2007,120(Pt 15):2479－2487.

13 Essafi A,Gomes AR,Pomeranz KM,et al.Studying the subcellular localization and DNA－binding activity of FoxO transcription factors,downstream effectors of PI3K/Akt.Methods Mol Biol,2009,462:201－211.

(收稿:2014－04－05 修回:2014－05－27)

The expressions of p－Akt and p－FoxO1 in the lesions of psoriasis vulgaris

HUANG Li-ning,XUE Ru-zeng,LUO Guang-pu,et al.Guangdong Provincial Dermatology Hospital,Guangzhou,510091

Objective:To detect the expression of p－Akt and p－FoxO1 in the lesions of psoriasis vulgaris. Methods:The levels of p－Akt and p－FoxO1 were detected by Western Blot in the lesions from 30 patients with psoriasis vulgaris and normal skin specimens from 30 healthy controls.Results:Compared with the controls,the expressions of p－Akt and p－FoxO1 were significantly up－regulated in psoriasis vulgaris lesions(P＜0.05).Conclusion:p－Akt and p－FoxO1 may contribute to the abnormal proliferation of keratinocytes in the lesions of psoriasis vulgaris.

psoriasis vulgaris；FoxO1；Akt；Western blot

廣東省皮膚病醫(yī)院,廣東廣州,510091

?通信作者