微體系HRP濃度與其催化化學發(fā)光衰減率線性關系研究

楊子巖+梁平+汪欽+雷小英+盧茲凡+郭晏海+向安

[摘 要] 目的：了解微體系辣根過氧化物酶（HRP）催化化學發(fā)光與其濃度的相關性。方法：將HRP經核酸序列偶聯(lián)于毛細管微腔內，通入微量反應底物進行化學發(fā)光檢測；分析HRP催化化學發(fā)光反應與其濃度的相關性。結果：毛細管內HRP催化1.5μL底物的化學發(fā)光反應可分成急速衰減區(qū)（3.5×10-4～1.3×10-4μg/μL）、衰減延緩區(qū)（9.7×10-5～3.3×10-5μg/μL）和發(fā)光平穩(wěn)區(qū)（1.0×10-5～6.7×10-7μg/μL）；濃度為3.5×10-4～6.7×10-6μg/μL的HRP催化化學發(fā)光衰減率RLUs/T>0且兩者線性相關（R2=0.967）。結論：分析微體系HRP濃度與化學發(fā)光衰減率（RLUs/T）的線性相關性，為微體系HRP化學發(fā)光定量檢測生物分子提供新策略。

[關鍵詞] 微反應體系；辣根過氧化物酶；化學發(fā)光衰減；線性相關性

中圖分類號：R331 文獻標識碼：A 文章編號：2055-5200（2014）01-001-05

Doi： 10.11876/mimt201401001

Linear relationship between concentration of HRP and its chemoluminescence decays in the micro-channel system YANG Zi-yan1，LIANG Ping2，WANG Qin2，LEI Xiao-ying2，LU Zi-fan2，GUO Yan-hai2，XIANG An2.（1. The second cadets team of Pharmacy School， the Fourth Military Medical University，710032；2. Department of Pharmacogenomics， School of Pharmacy， the Fourth Military Medical University；Institute of Gene diagnosis， PLA 710032）

[Abstract] Objective： Research the relationship between the concentration of horseradish peroxidase（HRP） and its chemiluminescence （CL） decays in micro-channel system. Method： Immobilize the HRP-streptavidin into a hydroxylation capillary， the micro-channel reaction system model in this study， with a single-stranded deoxyribonucleic acid （ssDNA） sequences that modify with biotin and amidogen. The relative luminescence units （RLUs） were being detected by a portable detector after injecting micro liter scale reaction substrates. Then the relationship between concentration of HRP and RLUs was been analysis through linear regression. Result： There were three RLUs characteristic regions， content rapidly decay in 3.5×10-4～1.3×10-4μg/μL， slowly decay in 9.7×10-5～ 3.3×10-5μg/μL and steady region of 1.0×10-5～ 6.7×10-7μg/μL， basic on the rate of decay of RLUs for different HRP concentration. Most important， the rate of decay of RLUs （RLUs/T） was linearly related to the concentration of HRP （3.5×10-4～6.7×10-6μg/μL， R2=0. 967）. Conclusion： The research of the linear relationship between concentration of HRP and RLUs/T afforded novel strategy for quantitative determination of biomolecules through chemiluminescent analysis in micro-channel system.

[Key words] micro-channel system； horseradish peroxidase （HRP）； chemiluminescence decays； linear relativity

前 言

微/納米反應體系[1-2]辣根過氧化物酶（HRP）催化化學發(fā)光檢測所需試劑/樣品用量少、反應快且高效靈敏，在核酸[3]、抗原/抗體[4-6]等生物分子檢測中應用廣泛。由于微體系比表面積大、反應效率高、底物容量有限等因素，即使暉光型底物也會被快速消耗[7]。由此導致的化學發(fā)光衰減增加了微體系HRP濃度與化學發(fā)光強度的量效關系分析難度。新型反應底物/穩(wěn)定劑[8]、流動注射進樣[9]和快敏檢測器[10-13]等研究雖在一定程度上提高了微體系HPR催化化學發(fā)光穩(wěn)定性，但也增加了檢測試劑成本和儀器價格。

為研究毛細管微體系內偶聯(lián)HRP催化化學發(fā)光衰減趨勢隨HPR濃度的變化，首先將不同濃度HRP通過核酸序列偶聯(lián)于毛細管微體系內；再加入反應底物后進行HRP催化學發(fā)光反應，檢測其化學發(fā)光相對強度值（RLUs）；進而分析微體系內不同濃度HRP催化化學發(fā)光相對強度，及其衰減率（RLUs/T）與HRP濃度的相關性。最終為微體系化學發(fā)光定量檢測生物分子提供新的分析策略。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及儀器

鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶（碧云天生物技術有限公司，上海），化學發(fā)光反應底物（賽默飛世爾科技有限公司，美國），玻璃毛細管（華西醫(yī)科大學（現(xiàn)四川大學醫(yī)學院）儀器廠，成都），毛細管化學發(fā)光檢測儀 （天隆科技有限公司/第四軍醫(yī)大學，西安），核苷酸連接臂（NH2-5-T10-3-biotin（生工生物工程有限公司，上海），3-氨基丙基三甲氧基硅烷、戊二醛等硅烷化試劑、硝酸溶液、氫氧化鈉等化學試劑（SIGMA中國有限公司，北京），超純水（Milli-Q Century超純水系統(tǒng)，美國）。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 毛細管微體系內辣根過氧化物酶的固定 玻璃毛細管內壁羥基化、氨基化、醛基化處理后，經核苷酸序列（NH2-5-T10-3-biotin）將鏈霉親和素-HRP固定于毛細管內壁。詳細方法參照[14， 15]。1. 玻璃毛細管（長10.0cm，內徑300μm）經HCl、NaOH處理進行羥基化；2. 經10%的3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES）/甲苯溶液處理進行氨基化；3. 經10%戊二醛的磷酸緩沖液（PBS，pH7.0）進行醛基化處理；4. 檢測端吸入20μM的5氨基/3生物素修飾寡核苷酸1.5μL（完成毛細管2cm區(qū)段標記），室溫/避光水平放置24h；5. 以0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液和水溶液清洗，毛細管浸入5%脫脂牛奶磷酸緩沖液（PBS， pH7.2）于37℃封閉2h；6. 以1.5μL不同濃度鏈霉親和素-HRP磷酸緩沖液（PBS， pH7.2）吸入毛細管標記端，放置30min，PBS清洗，48h內使用。

1.2.2 毛細管微體系內固定HRP催化化學發(fā)光 將偶聯(lián)有不同濃度（3.5×10-4～6.7×10-7μg/μL）HRP的毛細管檢測端吸入1.5μL現(xiàn)配化學發(fā)光底物A、B液等體積混合物，檢測化學發(fā)光相對發(fā)光強度，并分析一定時期內RULs衰減率[（RLUs1-RLUs2）/（T1-T2），簡寫為RLUs/T]。

1.2.3 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據采用SPSS統(tǒng)計軟件、Origin7.0科學繪圖軟件完成實驗中相對發(fā)光值（RLUs）， RLUs/T分析，數(shù)據作圖處理。

2 結果與討論

毛細管微體系內不同濃度（3.5×10-4～6.7×10-7 μg/μL）HRP催化1.5μL底物化學發(fā)光相對強度（RLUs）可分成急速衰減區(qū)、緩慢衰減區(qū)和平穩(wěn)區(qū)，具有不同RLUs衰減特征。

2.1 急速衰減區(qū)化學發(fā)光分析

2.2 衰減延緩區(qū)化學發(fā)光分析

毛細管微體系內濃度處于9.7×10-5～3.3×10-5μg/μL的HRP催化化學發(fā)光相對強度（RLUs）特征如圖2。初始RLUs接近檢測上限（9999 RLUs），經6min或更長時間衰減為零。與急速衰減區(qū)類似，無法從某時間點RLUs定量HRP濃度（圖2a）。HRP濃度與化學發(fā)光衰減率（RLUs/T）明顯線性相關（R2=0.948），如圖2b。隨著HRP濃度下降，單位時間消耗底物量開始下降，導致此區(qū)化學發(fā)光初始RLUs下降，反應期延長。為此出現(xiàn)不同濃度HRP化學發(fā)光RLUs變化出現(xiàn)交錯。但HRP濃度與發(fā)光衰減率（RLUs/T）仍線性相關。

2.3 發(fā)光平穩(wěn)區(qū)化學發(fā)光分析

毛細管微體系內濃度處于1.0×10-5～6.7×10-7μg/μL的HRP催化化學發(fā)光相對強度（RLUs）特征如圖3。各濃度HRP初始RLUs和整個反應期的RLUs水平已有明顯差異，發(fā)光反應6.5min后的RLUs并未如急速衰減區(qū)和延緩衰減區(qū)衰減為零，各濃度HRP的RLUs也未發(fā)生交錯（圖3a）。各濃度HRP化學發(fā)光衰減率（RLUs/T）如圖3b， HRP>6.7×10-6μg/μL時，HPR催化化學發(fā)光衰減率（RLUs/T）與其濃度仍然具有線性相關性（R2=0.948）。HRP>6.7×10-6μg/μL，即RLUs/T>0，HRP催化化學發(fā)光RLUs具有衰減趨勢（初始值 RLUsT0>反應期T1時RLUsT1）。RLUs/T≤0，HRP催化化學發(fā)光RLUs無變化或是有上升趨勢，此時的RLUs/T與HRP濃度間無線性相關性。

2.4 全程化學發(fā)光衰減率分析

3 結論

微體系HRP化學發(fā)光分析具有試劑/樣品用量少，反應迅速，檢測靈敏度高等優(yōu)勢。在生物分子檢測方面具有廣闊應用前景。但受腔道容量限制，所能容納的底物量十分有限。其化學發(fā)光反應衰減迅速，特別是較高濃度HRP情況下很難直接以發(fā)光強度值進行HRP定量分析。在前期研究基礎上，本研究以毛細管微通道為微反應體系模型，模擬微體系HRP酶促化學發(fā)光定量檢測偶聯(lián)核酸序列濃度，通過分析毛微體系內不同濃度HRP催化化學發(fā)光衰減特征，發(fā)現(xiàn)HRP濃度與化學發(fā)光衰減率（RLUs/T）在較寬濃度范圍具有線性相關性。 通過化學發(fā)光衰減率（RLUs/ T）定量檢測HRP濃度，可有效解決直接基于化學發(fā)光強度進行微體系HRP定量檢測范圍窄，檢測期短等缺點。其不足在于，如高濃度HRP催化化學發(fā)光RLU后期波動較大；化學發(fā)光衰減率需基于一定時期的RLUs差值與時間比值，因而增加了檢測的復雜度，也降低了檢測的時效性。但作為一種新的分析策略，它為微體系HRP化學發(fā)光分析在核酸、抗原/抗體等生物大分子定量檢測方面提供新思路。

參 考 文 獻

[1] LIU Y，LI Y.An antibody-immobilized capillary column as a bioseparator/bioreactor for detection of escherichia colio157：h7 with absorbance measurement[J].Analytical che mistry.，2001，73（21）：5180-5183.

[2] 王瑛.核酸的非同位素化學發(fā)光分析系統(tǒng)[J].生物工程進展，1995，（3）：18-24.

[3] Tracy Jordan，Lee Walus，Alex Velickovic，et al.A competitive chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of rmp-7 in human blood[J].J Pharm Biomed Anal，1996，14（12）：1653-1662.

[4] Bert Gold，DANIELA Radu，Alla Balanko，et al.Diagnosis of fragile x syndrome by southern blot hybridization using a chemiluminescent probe： a laboratory protocol[J].Molecular Diagnosis，2000，5（3）：169-178.

[5] NAKANO K，NAKAO T，SCHRAM K H，et al.Urinary excretion of modified nucleosides as biological marker of rna turnover in patients with cancer and aids.[J].Clin Chim Acta，1993，218（2）：169-83.

[6] DUFFY M J.Can molecular markers now be used for early diagnosis of malignancy？[J].Clin Chem，1995，41（10）：1410-3.

[7] Girotti S， Ferri E， Ghini S， et al. Direct quantitative chemiluminescent assays for the detection of viral DNA[J]. Analytica Chimica Acta， 1991， 255（2）：387-394.

[8] TSUKAGOSHI K，JINNO N，NAKAJIMA R.Development of a micro total analysis system incorporating chemiluminescence detection and application to detection of cancer markers[J].Analytical chemist ry.，2005，77（6）：1684-1688.

[9] BOWIE R A，ACHTERBERG P E，MANTOURA F C R，et al.Determination of sub-nanomolar levels of iron in seawater using flow injection with chemiluminescence detection[J].Anal Chim Acta，1998，361（3）：189-200.

[10] HUANG bo，LI Jianjun，ZHANG le，et al.On-line chemiluminescence detection for capillary ion analysis[J]. Anal Chem，1996，68（14）：2366-2369.

[11] Friesel， Milan，Baranowski， Bogdan，Lunden， Arnold. Pressure dependence of the transition to the proton conducting phase of cshso 4 ， cshseo 4 and rbhseo 4 studied by differential scanning calorimetry[J].Solid State Ionics，1989，35（1-2）：85-89.

[12] 李紅梅，陳佳，徐斐，等.ELISA測定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J].生物技術通報，2010，（2）：126-130.

[13] Manfred Renz ， Christina Ku.A colorimetric method for dna hybridization[J].Nucleic Acids Res.，1984，8（12）：3435-3444.

[14] Thomas P. Whitehead，Gary H. G. Thorpe，Timothy J. N. Carter，et al.Enhanced luminescence procedure for sensitive determination of peroxidase-labelled conjugates in immunoassay[J].Nature，1983，3（05）：158-159.

[15] Zhen Guo， Richard A. Guilfoyle， Andrew J. Thiel，et al.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports[J].Nucleic Acids Res.，1994，24（22）：5456-5465.

[16] 楊維平，章竹君. 固體表面發(fā)光法測定辣根過氧化物酶的研究[J]. 陜西師大學報：自然科學版，1995，23（2）：59-61.

參 考 文 獻

[1] LIU Y，LI Y.An antibody-immobilized capillary column as a bioseparator/bioreactor for detection of escherichia colio157：h7 with absorbance measurement[J].Analytical che mistry.，2001，73（21）：5180-5183.

[2] 王瑛.核酸的非同位素化學發(fā)光分析系統(tǒng)[J].生物工程進展，1995，（3）：18-24.

[3] Tracy Jordan，Lee Walus，Alex Velickovic，et al.A competitive chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of rmp-7 in human blood[J].J Pharm Biomed Anal，1996，14（12）：1653-1662.

[4] Bert Gold，DANIELA Radu，Alla Balanko，et al.Diagnosis of fragile x syndrome by southern blot hybridization using a chemiluminescent probe： a laboratory protocol[J].Molecular Diagnosis，2000，5（3）：169-178.

[5] NAKANO K，NAKAO T，SCHRAM K H，et al.Urinary excretion of modified nucleosides as biological marker of rna turnover in patients with cancer and aids.[J].Clin Chim Acta，1993，218（2）：169-83.

[6] DUFFY M J.Can molecular markers now be used for early diagnosis of malignancy？[J].Clin Chem，1995，41（10）：1410-3.

[7] Girotti S， Ferri E， Ghini S， et al. Direct quantitative chemiluminescent assays for the detection of viral DNA[J]. Analytica Chimica Acta， 1991， 255（2）：387-394.

[8] TSUKAGOSHI K，JINNO N，NAKAJIMA R.Development of a micro total analysis system incorporating chemiluminescence detection and application to detection of cancer markers[J].Analytical chemist ry.，2005，77（6）：1684-1688.

[9] BOWIE R A，ACHTERBERG P E，MANTOURA F C R，et al.Determination of sub-nanomolar levels of iron in seawater using flow injection with chemiluminescence detection[J].Anal Chim Acta，1998，361（3）：189-200.

[10] HUANG bo，LI Jianjun，ZHANG le，et al.On-line chemiluminescence detection for capillary ion analysis[J]. Anal Chem，1996，68（14）：2366-2369.

[11] Friesel， Milan，Baranowski， Bogdan，Lunden， Arnold. Pressure dependence of the transition to the proton conducting phase of cshso 4 ， cshseo 4 and rbhseo 4 studied by differential scanning calorimetry[J].Solid State Ionics，1989，35（1-2）：85-89.

[12] 李紅梅，陳佳，徐斐，等.ELISA測定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J].生物技術通報，2010，（2）：126-130.

[13] Manfred Renz ， Christina Ku.A colorimetric method for dna hybridization[J].Nucleic Acids Res.，1984，8（12）：3435-3444.

[14] Thomas P. Whitehead，Gary H. G. Thorpe，Timothy J. N. Carter，et al.Enhanced luminescence procedure for sensitive determination of peroxidase-labelled conjugates in immunoassay[J].Nature，1983，3（05）：158-159.

[15] Zhen Guo， Richard A. Guilfoyle， Andrew J. Thiel，et al.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports[J].Nucleic Acids Res.，1994，24（22）：5456-5465.

[16] 楊維平，章竹君. 固體表面發(fā)光法測定辣根過氧化物酶的研究[J]. 陜西師大學報：自然科學版，1995，23（2）：59-61.

參 考 文 獻

[1] LIU Y，LI Y.An antibody-immobilized capillary column as a bioseparator/bioreactor for detection of escherichia colio157：h7 with absorbance measurement[J].Analytical che mistry.，2001，73（21）：5180-5183.

[2] 王瑛.核酸的非同位素化學發(fā)光分析系統(tǒng)[J].生物工程進展，1995，（3）：18-24.

[3] Tracy Jordan，Lee Walus，Alex Velickovic，et al.A competitive chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of rmp-7 in human blood[J].J Pharm Biomed Anal，1996，14（12）：1653-1662.

[4] Bert Gold，DANIELA Radu，Alla Balanko，et al.Diagnosis of fragile x syndrome by southern blot hybridization using a chemiluminescent probe： a laboratory protocol[J].Molecular Diagnosis，2000，5（3）：169-178.

[5] NAKANO K，NAKAO T，SCHRAM K H，et al.Urinary excretion of modified nucleosides as biological marker of rna turnover in patients with cancer and aids.[J].Clin Chim Acta，1993，218（2）：169-83.

[6] DUFFY M J.Can molecular markers now be used for early diagnosis of malignancy？[J].Clin Chem，1995，41（10）：1410-3.

[7] Girotti S， Ferri E， Ghini S， et al. Direct quantitative chemiluminescent assays for the detection of viral DNA[J]. Analytica Chimica Acta， 1991， 255（2）：387-394.

[8] TSUKAGOSHI K，JINNO N，NAKAJIMA R.Development of a micro total analysis system incorporating chemiluminescence detection and application to detection of cancer markers[J].Analytical chemist ry.，2005，77（6）：1684-1688.

[9] BOWIE R A，ACHTERBERG P E，MANTOURA F C R，et al.Determination of sub-nanomolar levels of iron in seawater using flow injection with chemiluminescence detection[J].Anal Chim Acta，1998，361（3）：189-200.

[10] HUANG bo，LI Jianjun，ZHANG le，et al.On-line chemiluminescence detection for capillary ion analysis[J]. Anal Chem，1996，68（14）：2366-2369.

[11] Friesel， Milan，Baranowski， Bogdan，Lunden， Arnold. Pressure dependence of the transition to the proton conducting phase of cshso 4 ， cshseo 4 and rbhseo 4 studied by differential scanning calorimetry[J].Solid State Ionics，1989，35（1-2）：85-89.

[12] 李紅梅，陳佳，徐斐，等.ELISA測定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J].生物技術通報，2010，（2）：126-130.

[13] Manfred Renz ， Christina Ku.A colorimetric method for dna hybridization[J].Nucleic Acids Res.，1984，8（12）：3435-3444.

[14] Thomas P. Whitehead，Gary H. G. Thorpe，Timothy J. N. Carter，et al.Enhanced luminescence procedure for sensitive determination of peroxidase-labelled conjugates in immunoassay[J].Nature，1983，3（05）：158-159.

[15] Zhen Guo， Richard A. Guilfoyle， Andrew J. Thiel，et al.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports[J].Nucleic Acids Res.，1994，24（22）：5456-5465.

[16] 楊維平，章竹君. 固體表面發(fā)光法測定辣根過氧化物酶的研究[J]. 陜西師大學報：自然科學版，1995，23（2）：59-61.