紅平菇漆酶基因異源表達(dá)及對染料脫色的研究

鄭苗苗， 邵淑麗， 張東向， 張令昂， 焦戰(zhàn)戰(zhàn)

(齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

漆酶(laccase)是一種含銅的多酚氧化酶，屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族[1]。漆酶通過催化O2將4個電子還原生成水，底物作用范圍廣泛，在很多方面有較大的應(yīng)用價值[2-3]。最早由日本吉田在漆樹的分泌物中發(fā)現(xiàn)漆酶，隨后又在一些真菌中發(fā)現(xiàn)漆酶。近些年來，漆酶一直是醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域中十分活躍的研究熱點(diǎn)[3]。迄今為止，漆酶廣泛存在于植物、真菌、細(xì)菌、昆蟲中[2]。其中真菌中白腐菌是最重要的漆酶生產(chǎn)菌，但是該菌漆酶產(chǎn)量低、熱穩(wěn)定性差、生長周期較長，而且漆酶的分泌還需要酚類化合物作為誘導(dǎo)，不利于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)[4-5]。近年來，漆酶相關(guān)研究在國際上越來越受到重視，漆酶不僅具有降解木質(zhì)素特性，還能降解多種復(fù)雜化合物，所以漆酶在印染工業(yè)、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)及其他領(lǐng)域有相當(dāng)大的研究價值及應(yīng)用潛力，因此，探索廉價、安全的漆酶生產(chǎn)方法策略吸引了國內(nèi)外學(xué)者的興趣。國內(nèi)外學(xué)者已在對漆酶異源表達(dá)的研究方面有了許多報道。多個漆酶基因已實現(xiàn)了異源表達(dá)，宿主有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[6]、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)[7]和構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)[8]等。

染料的降解已成為污水處理的首要問題[9]。各種染料在化學(xué)結(jié)構(gòu)上差異較大，而且污染后的水對生物具有毒性。由于復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，許多染料很難降解。以往化學(xué)和物理方法處理廢水效果較差，而且成本高。白腐真菌漆酶在處理廢水中染料具有相當(dāng)大的優(yōu)勢。目前為止，白腐真菌降解染料是最有效的途徑[10]，因此，通過異源表達(dá)獲得的重組漆酶對染料脫色效率的研究，以及在污水處理中的應(yīng)用有著非常重要的研究價值。

紅平菇是一種味道鮮，具蟹味，既可作美味佳肴，又可作盆景觀賞的食用菌，也是一種白腐真菌。到目前為止，已經(jīng)對紅平菇的栽培技術(shù)、多糖的結(jié)構(gòu)和純化、抗腫瘤方面和保健功能以及相關(guān)基因等有了較深入的研究[11]。本文中所用的紅平菇菌株購自福建三明真菌研究所，菌株生長條件適合于北方地區(qū)栽培。由于紅平菇既具有食用價值，又具有分解各種合成染料的潛在能力，因此，研究其相關(guān)基因和異源表達(dá)具有十分重要意義。本文研究了紅平菇漆酶Pd-lac1基因在酵母中完成異源表達(dá)、酵母重組菌株分泌漆酶變化曲線和對不同復(fù)雜合成染料的脫色率，報道了從紅平菇中克隆的漆酶基因在畢赤酵母中實現(xiàn)了異源表達(dá)和分泌表達(dá)的產(chǎn)酶變化曲線，及重組漆酶對染料脫色的研究，為今后漆酶在治理環(huán)境方面的應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材 料

菌株：紅平菇菌株P(guān)leurotusdjamor，由齊齊哈爾大學(xué)生物技術(shù)學(xué)科微生物實驗室提供。PichiapastorisSMD1168H(菌株號)購自Invitrogen公司；E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，購自大連寶生物公司。

質(zhì)粒：表達(dá)載體pPICZB購自Invitrogen公司；克隆載體pMD18-T simple veetor購自大連寶生物公司。

YPD/Zeocin平板培養(yǎng)基：15 g/L蛋白胨；15 g/L瓊脂粉；15 g/L酵母粉；15 g/L葡萄糖； 100 μg/mL Zeocin。

Low Salt LB液體培養(yǎng)基：10 g/L酵母粉；5 g/L胰蛋白胨；10 g/L NaCl。

Low Salt LB/Zeocin平板培養(yǎng)基：5 g/L酵母粉；15 g/L瓊脂粉；10 g/L胰蛋白胨；5 g/L NaCl； 25 μg/mL Zeocin。

BMMY液體培養(yǎng)基：20 g/L蛋白胨；4×10-5%生物素；10 g/L酵母粉；50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值為6.5)； 1.34% YNB；1%甲醇。

BMGY液體培養(yǎng)基：20 g/L蛋白胨；4×10-5%生物素；10 g/L酵母粉；50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值為6.6)； 1.34% YNB； 1%甘油。

試劑：Zeocin、XbaI、BglⅡ、EcoRI限制性內(nèi)切酶(NEB)、T4 DNA連接酶(NEB)購自Invitrogen公司；DNAquick_真菌基因組DNA提取系統(tǒng)(TIANDZ)、E.Z.N.A真菌RNA提取試劑(TIANGEN)、兩步法RT-PCR試劑盒、TaKaRa Genome Walking Kit試劑盒、質(zhì)粒DNA小提試劑盒(TIANGEN)、高保真Taq酶、DL 15,000 DNA Marker(TaKaRa)、Tryptone、Yeast Extract(Oxoid)、生物素D-biotin(sigma)；山梨醇D-sorbitol(Difco)；溶壁酶Lyticase(Tiangen)；YNB(Difcol)、DMP(2,6-Dimethoxyphenol)、ABTS[2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic)]，購自大連寶生物公司。

1.2 紅平菇總RNA的提取

采用文獻(xiàn)[12]中優(yōu)化后的漆酶培養(yǎng)基培養(yǎng)紅平菇。用OMEGA試劑盒提取紅平菇總RNA，產(chǎn)物用核酸檢測儀測定純度，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗完整性。

1.3 紅平菇漆酶Pd-lac1完整CDS序列克隆

1.3.1試驗酶切引物的設(shè)計

擴(kuò)增漆酶CDS序列引物如表1所示。

表1 擴(kuò)增漆酶CDS序列引物Tab.1 Primers for amplifying laccase CDS

1.3.2漆酶完整CDS序列的PCR擴(kuò)增

使用二步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈擴(kuò)增，用酶切引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得漆酶CDS序列。反應(yīng)體系為50 μL，含5×Prime STARTM Buffer(Mg2+plus)9 μL，dNTP Mixture(10 mM)5 μL，Prime STARTM HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL，引物Pdlac1-RT1和Pdlac1-RT2各1 μL，反轉(zhuǎn)錄cDNA 5 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min，35個循環(huán)，72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果用TaKaRa Genome Walking Kit試劑盒純化，與pMD18-T simple veetor連接，轉(zhuǎn)化到E.coliJM109中，在含有IPTG、X-Gal、Amp的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，形成單菌落。挑取白色單菌落放入含有Amp抗性的液體LB培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)約8 h，提質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 紅平菇漆酶Pd-lac1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

首先用EcoRI、XbaI限制性內(nèi)切酶將目的基因Pd-lac1與載體pMD18-T Semple Vector進(jìn)行雙酶切，之后用T4 DNA連接酶將載體與Pd-lac1基因進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pPICZB-Pd-lac1，連接液轉(zhuǎn)化E.coliTop10，涂布在Low Salt LB/Zeocin平板上。隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析，轉(zhuǎn)化后送到生物公司進(jìn)行測序，驗證目的片斷是否Pd-lac1基因。

1.5 轉(zhuǎn)化畢赤酵母及鑒定轉(zhuǎn)化子

pPICZB-Pd-lac1質(zhì)粒用BglⅡ進(jìn)行酶切線性化。產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，保存?zhèn)溆?。Pichiapastoris在YPD平板上分離單菌落，28 ℃培養(yǎng)3 d，挑取酵母單菌落到5 mL YPD培養(yǎng)基中，取100～500 μL轉(zhuǎn)入100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h時OD600值為1.1～1.4。獲得細(xì)胞并重懸于70 mL冰冷無菌水中， 4 ℃、4 000 r/min離心3 min，重復(fù)3次。再將菌體重懸于5 mL冰冷的1 mol/L山梨醇中，4 ℃、4 000 r/min離心3 min。最后用200 μL 1 mol/L冰冷山梨醇懸浮細(xì)胞使其終體積為400 μL。獲得感受態(tài)細(xì)胞存放在冰塊上，當(dāng)天使用。

將質(zhì)粒pPICZB-Pd-lac1、0.2 cm電轉(zhuǎn)杯、酵母感受態(tài)細(xì)胞放在冰塊上預(yù)冷。設(shè)置轉(zhuǎn)化參數(shù)：電壓為1 600 V，電擊時間為6 ms。取5～10 μg線性化的重組質(zhì)粒與60 μL感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)至0 ℃預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中。在2 s之內(nèi)按PULSE鍵2次，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，之后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)3 h。加入1 mL YPD培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 h。取100 μL培養(yǎng)物涂布在含Zeocin的YPDS平板上，形成陽性轉(zhuǎn)化子。

以破壁后的酵母裂解液為模板，用特異性酶切引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件同1.3.2。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證Pd-lac1基因是否插入酵母染色體中。

1.6 含漆酶酵母重組子的誘導(dǎo)表達(dá)

將正確陽性轉(zhuǎn)化子菌落和含有空pPICZB載體的對照菌落分別接種至25 mL BMGY液體培養(yǎng)基。28 ℃振蕩培養(yǎng)至吸光值OD600為3～4之間。離心收集菌體，轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)96 h，每24 h加入無水甲醇至終用量為0.5%。每12 h取菌液進(jìn)行漆酶活性測定。

1.7 漆酶活性測定

1個酶活力單位定義為每分鐘氧化1 μmol底物所需的酶量。420 nm下檢測漆酶與底物在室溫反應(yīng)3 min的吸光度值。測定反應(yīng)體系為：空白對照管中加1.95 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH值為3.4)和50 μL稀釋后的酶液；檢測管中加0.95 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH值為3.4)，50 μL稀釋后的酶液，1 mL濃度為1 mmol/L的ABTS。測定結(jié)果重復(fù)3次。

1.8 粗漆酶的制備

將重組菌畢赤酵母pPICZB-Pd-lac1接種到BMGY培養(yǎng)基，27 ℃、240 r/min 振蕩培養(yǎng)15～25 h至吸光值OD600為2～6之間；然后將粗酶液經(jīng)4 000 r/min，離心12 min，收集沉淀重新懸浮BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，同時添加0.25 mmol/L的CuSO4溶液，振蕩培養(yǎng)，間隔一定時間加入5%甲醇作為誘導(dǎo)物，培養(yǎng)到第3天，離心收集粗酶液，在-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.9 漆酶的純化

對收集的上清液進(jìn)行超濾濃縮，通過DEAE-Sepharose CL-6B離子交換柱層析，再用聚乙二醇濃縮。收集漆酶蛋白，上樣到凝膠過濾層析柱SephadexG-75上，用pH值為6.5的20 mmol/L醋酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速設(shè)為0.5 mL/min，自動部分收集器收集100管，每管3 mL。對純化的漆酶蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行電泳。

1.10 粗酶液對合成染料的脫色

染料：SN4R，杭州方順化工有限公司；甲基橙，沈陽市新光化工廠公司；孔雀綠，上海撫生實業(yè)有限公司；中性紅，天津市大茂化學(xué)試劑廠。以上染料分別置于錐形瓶內(nèi)，放置在干燥、陰涼處妥善保管。

利用紫外-可見分光光度計在300～800 nm區(qū)間掃描，得到在此區(qū)間4種染料的最大吸收峰值：孔雀綠為558 nm，吸光度=3.511；中性紅為527 nm，吸光度=3.514；甲基橙為486 nm，吸光度=1.876；SN4R為432 nm，吸光度=0.659。脫色體系中加入50 mmol/L(pH值=4.6)檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液1 mL，分別從錐形瓶中吸取1 mL(40 mg/L)待降解4種染料，最后加入重組漆酶酶液1 mL 啟動反應(yīng)，在25 ℃下靜置反應(yīng)，每隔一定時間檢測4種染料吸光度值為A1；以同樣方法，反應(yīng)中加入等量含pPICZB載體的酵母酶液作對照，測其吸光度值為A0。脫色率計算公式為：

2 結(jié)果與討論

2.1 漆酶完整CDS序列的PCR擴(kuò)增

用酶切引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Pd-lac1 CDS全長序列，條帶大小為1.6 kb(見圖1)。圖中：泳道1—Marker 2000; 泳道2—對照; 泳道3—樣本。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，回收大小與PCR結(jié)果一致，約1.6 kb，將回收的CDS與載體連接、進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，挑取陽性菌落至含抗性液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以菌液為模板進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果為單一目的條帶，之后進(jìn)行質(zhì)粒提取，同時將菌液送到生物公司測序，進(jìn)一步驗證是否為漆酶CDS基因。將該序列測序結(jié)果輸入到GenBank中Blastx比對后，與其他真菌漆酶基因具有較高的同源性。其中與偏腫革裥菌Lenzitesgibbosa的基因序列同源性評價最高，相似性達(dá)86%，與褶孔栓菌Trametesgibbosa、氈毛栓孔菌Trametesvelutina、云芝Trametesversicolor的漆酶基因序列相似性達(dá)到77%～79%。GenBank上的登錄號為KF700372。

圖1 Pd-lac1的RT-PCR擴(kuò)增完整CDS序列結(jié)果Fig.1 Pd-lac1 by RT-PCR amplification of complete CDS sequence results

2.2 pPICZB-Pd-lac1表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

將帶有自身信號肽漆酶CDS克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZB的AOX1啟動子下游(見圖2)，表達(dá)載體pPICZB-Pd-lac1用EcoRI和XbaI進(jìn)行雙酶切，得到與漆酶CDS序列大小一致的片段，表明漆酶CDS序列已經(jīng)插入到表達(dá)載體pPICZB中，同時驗證了表達(dá)載體pPICZB雙酶切產(chǎn)物(見圖3)。其中泳道1為Marker 15000，泳道2～4為樣本。從Low Salt LB平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌液培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒pPICZB-Pd-lac1，進(jìn)行PCR驗證。將驗證正確的重組酵母菌株接種到含有Zeocin抗性的YPD培養(yǎng)基上，篩選轉(zhuǎn)化子。在YPD/Zeocin培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取3個重組酵母單菌落，破壁后分別用帶酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR驗證(見圖4)。圖中：泳道1為Marker 2000；泳道2為對照；泳道3～5為樣本。

圖2 重組表達(dá)載體pPICZB-Pd-lac1結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Construction of P. djamor expression pPICZB-Pd-lac1

注：1—pPICZB載體質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；2—重組質(zhì)粒雙 酶切驗證結(jié)果；3—完整CDS序列擴(kuò)增結(jié)果。圖3 酶切驗證結(jié)果Fig.3 Digested validation results

圖4 重組酵母菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Direct PCR screening of recombinant Pichia colonies

2.3 重組漆酶的誘導(dǎo)表達(dá)

分別挑取8株含有重組表達(dá)載體pPICZB-Pd-lac1和1株含空載體pPICZB的重組酵母進(jìn)行培養(yǎng)，從誘導(dǎo)開始，每天檢測重組菌漆酶酶活。從前者發(fā)酵液中檢測到漆酶酶活，空載體對照中沒有檢測到。酶活性較高的重組菌株發(fā)酵液，在72 h時最高漆酶活性達(dá)到54 U/L，之后漆酶活性逐漸下降(見圖5)。

圖5 重組畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的漆酶活性Fig.5 Enzyme activity of laecase of recombinant Pichia Pastoris under indueing condition

重組菌株在甲醇誘導(dǎo)下，第3天漆酶活性達(dá)到最高(54 U/L)，是原菌株漆酶活性的1.5倍，并且重組菌漆酶誘導(dǎo)時間比原菌株縮短了6 d[12]。近幾年，F(xiàn)lammulinavelutipes[13]、Pycnoporuscinnabarinus[14]、Pleurotussajor-caju[15]、Coriolusversicolor[16]和Trametessp. 420[17]等已經(jīng)實現(xiàn)異源表達(dá)，前3個重組菌株漆酶活性比本研究漆酶活性低；后2個重組菌株漆酶活性比本研究漆酶活性高，可能與表達(dá)載體選用自身信號肽有關(guān)，以及培養(yǎng)方法和條件因素有關(guān)。為提高紅平菇漆酶基因在畢赤酵母中表達(dá)的活性，在今后工作中可采取液體發(fā)酵罐并實施高密度發(fā)酵；或者通過培養(yǎng)基的優(yōu)化提高重組畢赤酵母pPICZB-Pd-lac1的高密度表達(dá)；還可對重組菌株進(jìn)行純化。通過以上方法，紅平菇漆酶基因異源表達(dá)活性會得到進(jìn)一步提高，從而實現(xiàn)重組菌株分泌目的蛋白在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

2.4 漆酶的分離純化

將培養(yǎng)6 d后的重組酵母粗酶液進(jìn)行超濾，SephadexG-75凝膠層析和DEAE-Sepharose陰離子交換層析純化后經(jīng)檢測為單一條帶，大小約為62.5 kDa，與預(yù)測紅平菇漆酶分子質(zhì)量大小相似，表明大部分雜蛋白在純化過程中得到去除(見圖6)。圖中：泳道1—對照; 泳道2—樣本; 泳道3—Marker。

圖6 漆酶純化后的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of recombinant laccase fron P. pastoris

2.5 重組菌株漆酶Pd-lac1對染料的脫色

分別在4種染料最大吸收峰下檢測其吸光度，從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)Pd-lac1重組畢赤酵母菌株，當(dāng)漆酶活性到達(dá)最大值時，每間隔12 h吸取1 mL粗酶液，6 000 r/min離心4 min，檢測重組漆酶對不同染料的脫色效率。反應(yīng)體系：檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH值3.4)1 mL、粗酶液1.5 mL和不同種染料2.5 mL。反應(yīng)條件為25 ℃。空白實驗不加粗酶液檢測對染料脫色效率。所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次取平均值。SMD1168H(pPICZB)作對照。

經(jīng)過計算，Pd-lac1重組畢赤酵母菌株對SN4R的脫色率在24 h達(dá)到最大值，為52.8%，對中性紅、甲基橙和孔雀綠在24 h脫色效率達(dá)到最大值，分別為14.8%、14.5%和0.24%；而對照組隨著時間變化都沒有檢測到脫色效果，對4種染料脫色效率隨時間變化曲線見圖7。

圖7 Pd-lac1重組畢赤酵母菌株對染料脫色效率結(jié)果Fig.7 Decolorization efficiency of Pd-lac1 recombinant Pichia strains on alizarin red (a), neutral red (b), methyl orange (c), and malachite green (d)

3 結(jié) 論

隨著人工合成染料的使用量及排放量的逐年上升，環(huán)境污染及水體污染問題日趨嚴(yán)重。SN4R、甲基橙、中性紅和孔雀綠4種染料在自然水體中很難被生物降解，而且還具有毒性，另外染料還會影響水體的透明度，使水體質(zhì)量受到嚴(yán)重的破壞。本文研究結(jié)果顯示，重組菌株漆酶在不需要小分子介體物質(zhì)的參與情況下，對4種合成染料都具有降解能力。并且對SN4R染料的降解，在24 h脫色率達(dá)到53.8%，而原菌株紅平菇粗酶液對SN4R染料在24 h時脫色率為49.4%，證明重組菌株漆酶具有較高的脫色效率；而對中性紅、甲基橙、孔雀綠3種染料的脫色效率較低，因為SN4R屬于蒽醌類染料，化學(xué)結(jié)構(gòu)比雜環(huán)類中性紅、偶氮類甲基橙和三苯基甲烷類孔雀綠相對簡單，容易分解，因此重組菌株漆酶對SN4R染料脫色具有較大的應(yīng)用潛力，進(jìn)而對含蒽醌類染料廢水處理具有更好的應(yīng)用前景。

總之，本文研究從Pleurotusdjamor克隆了一條漆酶基因，并實現(xiàn)了在畢赤酵母中的異源表達(dá)及重組漆酶對不同染料的脫色效率，為進(jìn)一步研究異源表達(dá)優(yōu)化后染料脫色及重組漆酶純化奠定了基礎(chǔ)。

FZXB

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