聚乳酸/聚乙醇酸新型納米支架載藥體系研制

崔國艷, 顏 娜, 韓 冰

(1. 長治醫(yī)學院 微生物學教研室， 山西 長治 046000; 2. 北京大學口腔醫(yī)院 特診科， 北京 100081; 3. 北京大學 口腔醫(yī)學院， 北京 100081)

靜電紡絲技術是目前制備超細纖維最重要的方法之一，在傳感器、防護服和電子元件等領域，尤其在生物醫(yī)學領域用來制作藥物傳輸與緩控釋放的載體及創(chuàng)傷敷料等有著廣泛的應用[1-2]。導致組織再生手術失敗的最主要原因是術后細菌感染，尤其是在牙周手術中,由于骨骼替代物、手術感染和術后繼發(fā)感染往往導致牙周炎的發(fā)生，這些炎癥并發(fā)癥嚴重影響了骨組織再生的治療[3-5]。如今，載抗炎藥物的局部緩釋系統(tǒng)由于其長期治療效果和副作用少等優(yōu)點[6-7]，正成為生物醫(yī)學治療的熱點。目前應用的各種引導骨再生(guided bone regeneration, GBR)生物膜大都只起機械性的阻擋作用，療效欠佳，而且在操作及后期使用中經(jīng)常出現(xiàn)暴露、創(chuàng)口感染等問題，嚴重影響成功率，因此開發(fā)具有抗菌活性的GBR膜尤為重要[8-9]。

聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)納米纖維膜具有良好的生物降解性能、力學性能和生物相容性，在生物體內可逐步降解為水和二氧化碳，對人體無害、無積累[10]，然而其降解后形成的局部酸性也會導致周圍器官和組織產(chǎn)生炎癥反應，這也是人工合成的可降解聚酯類聚合物作為生物材料使用時所共有的缺陷。鹽酸四環(huán)素是一種廣譜抗生素, 沒有免疫反應，滲透能力強，具有抗膠原酶活性、抑制骨吸收、消炎和預防組織破壞等作用，常用于預防手術后感染[11-12]。本文將其作為抗菌添加劑，以期制備一種安全、穩(wěn)定、高效的聚乳酸聚乙醇酸抗菌納米纖維，為其在再生醫(yī)學和組織工程材料領域的應用奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 主要材料和儀器

聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA，質均相對分子質量Mw=50 000，美國Sigma公司),鹽酸四環(huán)素(Tet, 美國Sigma公司),四氫呋喃(THF)，N-N二甲基甲酰胺(DMF)。改良Eagle′s培養(yǎng)基(MEM)、胰蛋白酶和胎牛血清(美國Gibco公司)；人成骨樣細胞(MG-63)(北京協(xié)和醫(yī)學院)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，紫外光分光光度計(Perkin-Elmer公司)，水平離心機(德國Heraeus公司)，靜電紡絲機(北京化工大學)，日立S- 4700 FEG掃描電子顯微鏡，熒光顯微鏡(日本Nikon E800公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1載藥納米纖維膜的制備

將PLGA溶于四氫呋喃和N-N二甲基甲酰胺(體積比為1∶1)的混合溶液中,磁力攪拌,以形成均一的聚合物溶液;將質量分數(shù)為3%、5%、10%的Tet溶解在少量的甲醇中，然后滴入PLGA溶液中，超聲波充分攪拌得到一種均質的前驅體溶液。

將前驅體溶液裝入一個20 mL(內徑為0.7 mm)配備一個無污染鋼針頭的玻璃注射器中。靜電紡工藝參數(shù)為：電壓15～20 kV，接收距離15～20 cm，流速0.3～0.5 mL/h，以滾筒(d=9 cm，2 500～3 000 r/min)為接收裝置進行靜電紡絲，制備出加載鹽酸四環(huán)素的PLGA納米纖維膜，常溫下真空干燥1周以完全去除殘液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PLGA/Tet納米纖維膜形貌的表征

制備的納米纖維膜真空干燥后，噴金，掃描電鏡觀察其微觀形貌。用ImageJ[13]軟件測量納米纖維的直徑，隨機選取100根纖維計算纖維的平均直徑。在發(fā)射波長為360～400 nm處，用熒光顯微鏡觀察鹽酸四環(huán)素在納米纖維表面的分布狀況。

1.2.3體外釋放率

稱取不同理論載藥量的納米纖維膜各10 mg，溶解在2 mL THF和DMF(體積比為1∶1)的混合溶液中，然后添加10 mL PBS緩沖溶液 (pH=7.4)，超聲振蕩，至藥物完全溶解。離心(5 000 r/min)20 min，將水相吸出。采用分光光度計在360 nm波長處測定其吸光度。對應標準曲線方程計算藥物濃度。標準曲線可通過檢測標準濃度的鹽酸四環(huán)素溶液的吸光度來獲得。

稱取不同載藥量的納米纖維膜各10 mg，浸入含5 mL PBS的溶液(pH=7.4)中，置于轉速為120 r/min，溫度為37 ℃的恒溫水浴振蕩器中。在設定的時間間隔取出5 mL的釋放液，然后補加同等體積的新鮮PBS溶液。將取出的釋放液采用分光光度法在360 nm波長處測其吸光度，對應標準曲線方程，計算載藥纖維的藥物濃度及釋藥量，然后計算累積釋藥百分率并作累積釋藥曲線。

1.2.4體外抑菌性能檢測

將凍干保存的金黃色葡萄球菌 (ATCC 33592)在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在625 nm處調整菌液濃度使其吸光度值介于0.1和0.2之間，然后將其分裝到5 mL離心管中，稱取3種不同載藥量的納米纖維膜各0.1 mg，分別加入離心管中，37 ℃孵育，并不斷振蕩，24 h后所得結果用SPSS 10.0進行數(shù)據(jù)分析。

用改良的Kirby-Bauer紙片擴散法[14]分析其抑菌性能。將3種不同載藥量的納米纖維膜及陰性對照裁成1 cm×1 cm大小，置于瓊脂平板上，于37 ℃下培養(yǎng)4 h,使膜中的藥物擴散到瓊脂中。將平皿在37 ℃下干燥2 h，取出膜后向瓊脂平板上加入100 μL金黃色葡萄球菌的菌液, 于37 ℃培養(yǎng)12 h和48 h后，觀察菌落的生長情況。

1.2.5體外生物相容性檢測

將不同載藥量納米纖維膜切成直徑約為10 mm的圓片, 浸入細胞培養(yǎng)液24 h，然后覆蓋于24孔板底部。MG-63細胞用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，以104/孔密度接種于膜上，標準環(huán)境下孵育(37 ℃，5%CO2)，每2～3 d換液。于第3天和7天取出, 用PBS溶液(pH=7.4)洗去殘余培養(yǎng)液,2.5%戊二醛固定，4 ℃下靜置適當時間。采用梯度乙醇脫水(20%、50%、70%、90%),每個濃度梯度脫水10 min,然后用100%乙醇脫水2次，每次10 min，臨界點干燥,噴金，采用掃描電鏡觀察試樣形貌。

2 結果分析

2.1 納米纖維形貌的表征

圖1示出同一紡絲工藝下，添加不同質量分數(shù)Tet的納米纖維膜掃描電鏡照片。

圖1 不同質量分數(shù)Tet納米纖維的SEM照片(×5 000)Fig.1 SEM images of PLGA/ Tet nano-fibrous at different mass fraction(×5 000)

由圖1可見，添加不同比例的Tet后仍能制備出均勻、連續(xù)、表面光滑的聚乳酸/聚乙醇酸納米纖維，各纖維膜中纖維交錯重疊，光滑均一，沒有明顯的珠狀膨大結構或纖維黏連現(xiàn)象，呈現(xiàn)出三維網(wǎng)絡結構，且纖維表面觀察不到藥物結晶的存在，表明該藥物已滲入納米纖維中。不同載藥量的纖維直徑無顯著差異，平均直徑在360～470 nm之間。

2.2 熒光顯微鏡形貌觀察

盡管得到了光滑均一的PLGA/Tet納米纖維膜,還不能確認Tet是否均勻分布在納米纖維上，需熒光顯微鏡進行觀察，如圖2所示。由圖可直觀地看出，質量分數(shù)為10%鹽酸四環(huán)素很好地負載在PLGA納米纖維內部，纖維表面光滑均一，表明鹽酸四環(huán)素成功包裹于納米纖維內部。

圖2 10%鹽酸四環(huán)素在PLGA/Tet納米 纖維膜上的熒光顯微圖Fig.2 Fluorescence micrograph of 10% Tet loaded PLGA fibrous membrane

2.3 PLGA /Tet納米纖維的體外釋藥性能

不同載藥量PLGA/Tet納米纖維膜的體外釋藥曲線見圖3。

圖3 不同載藥量PLGA/ Tet納米纖維膜的 體外釋藥曲線Fig.3 In vitro release profiles of Tet from PLGA/Tet electrospun nanofibers of different drug loadings

由圖可見，不同載藥量的納米纖維膜初期釋藥速率很快，隨著時間的延長，藥物的釋放速度趨于平緩。其中載藥量為10%的納米纖維突釋現(xiàn)象最明顯，在24 h內的釋放量可達80%以上。且3種載藥量的納米纖維藥物釋放持續(xù)時間都在27 d以上。突釋現(xiàn)象是由于纖維表層的藥物擴散阻力小，易擴散到溶液中，故導致瞬時釋放；當大部分藥物釋放后，表面及靠近表面的藥物已釋放完畢，其余藥物只能從纖維內部向表面擴散再釋放，故導致后期釋藥速率減緩[15-16]。隨著藥物含量的增加，突釋現(xiàn)象越明顯。這可能是由于隨著藥物含量的增大，擴散的濃度梯度增大，更有利于藥物擴散到媒介中。對于抗菌藥物而言,一定量的突釋是有利的,因為初期高濃度的藥物可殺死入侵的細菌，而后期持續(xù)釋放的抗生素也是必要的,可防止其進一步的入侵以預防術后感染[17]。

2.4 體外抗菌活性

不同載藥量的PLGA納米纖維膜體外抗金黃色葡萄球菌性能如圖4所示。

圖4 37 ℃共孵育12 h和48 h的抑菌活性的分析結果Fig.4 Bacteria inhibition zone at 37 ℃ for 12 h and 48 h respectively at sites of membranes. (a) Different drug loadings of nanofibers; (b) Bacteria inhibition zone of 12 h; (c) Bacteria inhibition zone of 48 h

由圖可見，納米纖維與金黃色葡萄球菌在37 ℃共同孵育12 h和48 h后，平皿中放置載藥納米纖維膜的位置出現(xiàn)了抑菌環(huán)，說明藥物擴散到培養(yǎng)基中，且有效抑制了金黃色葡萄球菌生長。載藥量為10%的納米纖維膜的抑菌環(huán)直徑最大，這意味著加載Tet的量越多，納米纖維膜釋放的Tet越多，抗菌活性也越強；同時,也證實了加載Tet的納米纖維膜釋放的Tet保留了它的生物學性能。相比之下,載藥量為0的納米纖維膜沒有抑菌環(huán)，導致細菌的增長。另一方面,培養(yǎng)48 h的抑菌環(huán)直徑明顯小于培養(yǎng)12 h的,可能是隨著時間的延長，突釋減緩，Tet的抑菌能力下降。Kim等[18]報道加載頭孢西丁鈉的PLGA納米纖維膜也出現(xiàn)同一現(xiàn)象，他們認為隨著時間延長，藥物結構分解,導致抑菌環(huán)減小。盡管抑菌能力下降,但藥物的抗菌活性仍有效且持續(xù)地釋放，因此，只要加載Tet的PLGA納米纖維膜持續(xù)釋放Tet，金黃色葡萄球菌的生長就會受到抑制,在預防組織再生術后粘連和感染中發(fā)揮一定作用。

2.5 體外生物相容性分析

圖5示出不同質量分數(shù)的納米纖維膜和MG-63細胞體外共培養(yǎng)的電鏡圖片。從圖中可看出，MG-63細胞分別培養(yǎng)3 d和7 d后，細胞呈片狀分布在膜上，多個細胞相互交聯(lián)，說明細胞在支架上黏附和鋪展良好。細胞分別培養(yǎng)3 d和7 d時，隨著Tet加載量越多，細胞增殖越好。加載10%Tet的纖維膜與加載3%和5%的纖維膜相比，其MG-63細胞的形態(tài)和密度無顯著差異，這說明PLGA/Tet支架有利于細胞的黏附和增殖。作為一個藥物緩釋體系，PLGA /Tet膜應能夠控制藥物的釋放和吸收，使藥物緩釋，藥效持續(xù)。MG-63細胞培養(yǎng)結果表明, 加載不同比例Tet的PLGA/Tet膜都有很好的生物相容性。這與Park等[19]證實的加載Tet的PLLA支架適于成骨細胞的黏附和生長結果一致，因此，可考慮PLGA/Tet膜作為藥物緩釋體系植入體內以促進組織愈合。

圖5 MG-63在不同載藥量的納米 纖維膜上的黏附和增殖Fig.5 Attachment and proliferation of MG-63 on different drug loadings nanomembrane

3 結 論

該纖維的紡絲工藝條件為：Tet的添加比例3%、5%、10%，紡絲電壓15～20 kV，接收距離15～20 cm，流速0.3～0.5 mL/h；能夠成功制備出均勻、光滑的PLGA/Tet納米纖維；所制纖維都存在突釋現(xiàn)象，且加載10% Tet的納米纖維的突釋現(xiàn)象最明顯，其釋藥時間可持續(xù)27 d以上。體外抗菌活性結果表明：加載Tet的量越多，抗菌活性越強，且培養(yǎng)12 h的抑菌圈直徑大于培養(yǎng)48 h的；體外細胞相容性測試結果表明PLGA/Tet支架具有良好的生物相容性，可作為物理屏障分隔受傷的組織和鄰近組織。

FZXB

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