蓖麻愈傷組織對(duì)銅的抗性研究

康 薇，董化洋，金裕華，閔建華，鄭 進(jìn),2

(1.湖北理工學(xué)院，湖北 黃石 435003；2.礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復(fù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435003)

植物修復(fù)是利用綠色植物對(duì)重金屬的超富集作用來(lái)降低土壤的重金屬含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)重金屬污染土壤的治理。由于具有物理、化學(xué)修復(fù)所無(wú)法比擬的費(fèi)用低、不破壞場(chǎng)地結(jié)構(gòu)、不造成地下水二次污染以及能夠進(jìn)行大規(guī)模治污等優(yōu)勢(shì)，植物修復(fù)被認(rèn)為是國(guó)際上最有前途的土壤重金屬污染治理技術(shù)[1]。近年來(lái)，隨著Ni、Zn、Mn、Pb、Cd、Cu等多種重金屬超富集植物的相繼被發(fā)現(xiàn)和各種先進(jìn)理化分析測(cè)試手段的應(yīng)用，該領(lǐng)域已經(jīng)成為重金屬污染土壤修復(fù)研究的熱點(diǎn)，在超富集植物對(duì)重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和體內(nèi)解毒機(jī)制等方面取得了很大的進(jìn)展[2-7]。但是，這些成果主要來(lái)自對(duì)成體植物的研究，較少涉及離體培養(yǎng)的植物組織或細(xì)胞。離體培養(yǎng)的植物材料相對(duì)于成體植物而言，具有重復(fù)性好、培養(yǎng)條件易于控制和不受自然環(huán)境影響等特點(diǎn)，其在研究植物重金屬超富集機(jī)理方面的潛在優(yōu)勢(shì)已經(jīng)引起人們的關(guān)注[8]。

蓖麻(RicinuscommunisL.)是一種新發(fā)現(xiàn)的銅超富集植物，在修復(fù)銅污染土壤方面具有較大的潛力[9-10]。作者在前期研究中，采用組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)出蓖麻愈傷組織，并對(duì)愈傷組織的耐銅性進(jìn)行了初步測(cè)試[11]。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)研究銅脅迫下蓖麻愈傷組織的增長(zhǎng)及其銅吸收，探討蓖麻愈傷組織對(duì)銅的抗性，為進(jìn)一步篩選銅抗性蓖麻細(xì)胞及其超富集機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

蓖麻愈傷組織由本課題組采用蓖麻種胚誘導(dǎo)獲得[11]。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基[11]：MS培養(yǎng)基，6-BA 0.8 mg·L-1，NAA 0.2 mg·L-1，瓊脂 6 g·L-1，蔗糖30 mg·L-1。

愈傷組織繼代培養(yǎng)條件：溫度(26±2) ℃，光照14 h·d-1，光照強(qiáng)度3 000 lux。

1.3 愈傷組織培養(yǎng)及銅抗性測(cè)定

將CuSO4·5H2O配制成水溶液，按質(zhì)量濃度10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1、60 mg·L-1、70 mg·L-1、80 mg·L-1分別加入到愈傷組織繼代培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度5瓶，每瓶裝有培養(yǎng)基100 mL，接種愈傷組織2 g。以培養(yǎng)基不加CuSO4·5H2O為對(duì)照，3次重復(fù)。接種培養(yǎng)后，每隔7 d取出3瓶測(cè)愈傷組織鮮質(zhì)量后，將愈傷組織置于60 ℃干燥箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，稱量，取平均值，并按下式計(jì)算愈傷組織對(duì)銅的抗性指數(shù)：

式中：m1為處理愈傷組織干質(zhì)量；m2為對(duì)照愈傷組織干質(zhì)量。

1.4 愈傷組織銅含量測(cè)定

將新鮮的愈傷組織取出后，先用濃度為10 mmol·L-1的Sr(NO3)2溶液沖洗2～3次，洗去愈傷組織表面吸附的銅離子，再用去離子水沖洗3～4次。用火焰原子吸收光譜儀(Varian AA240FS)測(cè)定愈傷組織銅含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 愈傷組織增長(zhǎng)量與銅濃度的關(guān)系(圖1)

圖1 培養(yǎng)4周后不同銅濃度條件下愈傷組織增長(zhǎng)量Fig.1 The growth of the callus after culturing 4 weeks under different copper concentrations

由圖1可以看出，愈傷組織的增長(zhǎng)量與培養(yǎng)基銅濃度關(guān)系密切，隨著銅濃度的增大，愈傷組織增長(zhǎng)量呈下降趨勢(shì)，并且愈傷組織鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的下降趨勢(shì)基本一致。培養(yǎng)4 周后，對(duì)照和銅濃度(mg·L-1)為10、20、30、40、50、60、70、80各處理愈傷組織的干質(zhì)量平均增長(zhǎng)量(mg·L-1)依次為0.62、0.58、0.54、0.45、0.38、0.30、0.21、0.23、0.21，可見(jiàn)，培養(yǎng)基銅濃度超過(guò)60 mg·L-1后，愈傷組織的生長(zhǎng)明顯受到抑制，其增長(zhǎng)基本處于停止?fàn)顟B(tài)。用銅濃度(mg·L-1)為20、40、60的培養(yǎng)基分別連續(xù)繼代培養(yǎng)愈傷組織6周后，銅濃度為40 mg·L-1條件下，愈傷組織呈淡黃色，增殖較快，基本能夠適應(yīng)培養(yǎng)基的高銅環(huán)境(圖2)。

圖2 連續(xù)繼代培養(yǎng)6周的愈傷組織Fig.2 The callus after culturing 6 weeks under different copper concentrations

銅是植物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，但過(guò)量的銅會(huì)對(duì)植物造成傷害。一般認(rèn)為，水培介質(zhì)中植物銅中毒的臨界值是0.06 mg·L-1[12]。植物組織培養(yǎng)中常用的MS培養(yǎng)基，其銅濃度為0.025 mg·L-1。相對(duì)于成體植物而言，愈傷組織對(duì)銅更為敏感，本實(shí)驗(yàn)中蓖麻愈傷組織能夠在銅濃度為40 mg·L-1的培養(yǎng)基上完成多次繼代，表現(xiàn)出較強(qiáng)的銅抗性。

2.2 愈傷組織對(duì)銅的抗性

楊居榮等認(rèn)為，抗性是指生物對(duì)不良條件的抵抗能力，抗性的產(chǎn)生可由先天遺傳，也可以由后天獲得[13]。離體培養(yǎng)的蓖麻愈傷組織在銅污染條件下，能夠正常繼代增殖，表明其具有較強(qiáng)的抗變能力。通過(guò)計(jì)算抗性指數(shù)(圖3)可知，不同培養(yǎng)時(shí)間愈傷組織對(duì)銅的抗性指數(shù)差異較大。在培養(yǎng)的第1 周，抗性指數(shù)較大，但各處理間抗性指數(shù)差異不明顯，這可能與愈傷組織處在接種后的啟動(dòng)培養(yǎng)階段，對(duì)培養(yǎng)基養(yǎng)分吸收不大有關(guān)。從第2周開(kāi)始，隨著銅濃度的增大，各處理抗性指數(shù)逐漸降低。到第4周，銅濃度為60 mg·L-1、70 mg·L-1、80 mg·L-1處理的抗性指數(shù)僅為33.87%、37.10%和33.87%，愈傷組織的生長(zhǎng)受到抑制；銅濃度為10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1處理具有較高的抗性指數(shù)，依次為93.55%、87.10%、72.58%、61.29%，并且都高于第3周的抗性指數(shù)。可能的原因是，延長(zhǎng)馴化處理時(shí)間，可以產(chǎn)生更好的抗性效果[13]。參考愈傷組織在銅濃度為40 mg·L-1條件下繼代培養(yǎng)6周的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)基銅濃度40 mg·L-1可以作為篩選銅抗性蓖麻愈傷組織的臨界值。

圖3 愈傷組織對(duì)銅的抗性指數(shù)Fig.3 Copper-resistant indexes of the callus

2.3 愈傷組織對(duì)銅的吸收

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)期愈傷組織的銅含量Fig.4 Copper content of the callus in different culturing periods

通過(guò)測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)期愈傷組織的銅含量(圖4)可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織的銅含量呈上升趨勢(shì)，但不同時(shí)間段銅含量的升幅明顯不同；在第2周之前，上升速度較快，第2周開(kāi)始減緩，到第3周和第4周基本維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。第4周銅濃度(mg·L-1)為10、20、30、40、50、60、70、80各處理愈傷組織的銅含量(mg· g-1)依次為0.33、0.54、1.16、1.40、1.55、1.64、1.65、1.62，表現(xiàn)出較強(qiáng)的銅吸收作用。

茅野充男[13]認(rèn)為，植物重金屬抗性機(jī)制具有多方面的表現(xiàn)，一種方式是減少對(duì)重金屬的吸收量；另一種方式是重金屬進(jìn)入植物體內(nèi)后與體內(nèi)某些物質(zhì)結(jié)合，形成無(wú)毒或者毒性低的產(chǎn)物，減輕對(duì)植物的傷害；還有其它的生化、生理應(yīng)急機(jī)制等。本實(shí)驗(yàn)中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蓖麻愈傷組織銅含量呈現(xiàn)出類似于飽和吸收的相對(duì)穩(wěn)定現(xiàn)象，是否為植物對(duì)重金屬脅迫環(huán)境的一種適應(yīng)機(jī)制，有待在今后的研究中加以探討。

3 結(jié)論

通過(guò)向培養(yǎng)基中添加不同濃度的銅，研究了銅脅迫下蓖麻愈傷組織對(duì)銅的抗性與吸收作用。結(jié)果表明，愈傷組織的增長(zhǎng)量與培養(yǎng)基中銅濃度關(guān)系密切，隨著銅濃度的增大，愈傷組織增長(zhǎng)量呈下降趨勢(shì)。銅濃度為60 mg·L-1時(shí)，愈傷組織的增長(zhǎng)基本處于停止?fàn)顟B(tài)；銅濃度為40 mg·L-1時(shí)，愈傷組織呈淡黃色，增長(zhǎng)較快，表現(xiàn)出較強(qiáng)的銅抗性，并且這種抗性可以保持至連續(xù)繼代培養(yǎng)6周之后。愈傷組織對(duì)銅的抗性與培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基銅濃度密切相關(guān)，不同培養(yǎng)時(shí)間愈傷組織對(duì)銅的抗性指數(shù)差異較大，培養(yǎng)至第4周時(shí)，銅濃度為60 mg·L-1、70 mg·L-1、80 mg·L-1處理的抗性指數(shù)僅為33.87%、37.10%和33.87%，銅濃度為10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1處理的抗性指數(shù)依次達(dá)到93.55%、87.10%、72.58%和61.29%，并且都高于第3周的抗性指數(shù)。因此，培養(yǎng)基銅濃度40 mg·L-1可以作為篩選銅抗性蓖麻愈傷組織的臨界值。實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)，蓖麻愈傷組織具有較強(qiáng)的銅吸收作用，第4周銅濃度(mg·L-1)為10、20、30、40、50、60、70、80各處理愈傷組織的銅含量(mg· g-1)依次為0.33、0.54、1.16、1.40、1.55、1.64、1.65、1.62。

[1] Kumar N P B A,Dushenkov V,Motto H,et al.Phytoextraction:The use of plant to remove heavy metals from soils[J].Environment Science Technology,1995，29(5):1232-1238.

[2] Mijovilovich A,Leitenomaier B,Meyer-klaucke W,et al.Complexation and toxicity of copper in higher plants.Ⅱ.Different mechanisms for copper versus cadmium detoxification in the copper-sensitive cadmium/zinc hyperaccumulatorThlaspicaerulescens(Ganges Ecotype)[J].Plant Physiology,2009,151(2):715-731.

[3] Kachenko A G,Singh B,Bhatia N.The role of low molecular weight ligands in nickel hyperaccumulation inHybanthusfloribundussubspeciesfloribundus[J].Plant Biology,2010,37:1143-1150.

[4] Castillo O S,Dasgupta-Schubert N,Alvarado C J,et al.The effect of the symbiosis betweenTageteserectaL.(marigold) andGlomusintraradicesin the uptake of copper(Ⅱ) and its implications for phytoremediation[J].New Biotechnology,2011,29(1):156-164.

[5] Chen K F,Yeh T Y,Hsu Y H,et al.The phytoattenuation of the soil metal contamination:The effects of plant growth regulators(GA(3) and IAA) by employing wetland macrophyte vetiver and energy plant sunflower[J].Desalination and Water Treatment，2012,45(1-3):144-152.

[6] Xie W J,Wang H Y,Xia J B,et al.Influence of N,P and K application onZeamaysL.growth and Cu and Pb accumulation[J].Plant Soil and Environment，2011,57(3):128-134.

[7] Yang L X,Luo C L,Chen Y H,et al.Copper-resistant bacteria enhance plant growth and copper phytoextraction[J].International Journal of Phytoremediation,2013,15(6):573-584.

[8] Klein M A,Sekimoto H,Milner M J,et al.Investigation of heavy metal hyperaccumulation at the cellular level:Development and characterization ofThlaspicaerulescenssuspension cell lines1[J].Plant Physiology,2008,147(4):2006-2016.

[9] 鄭進(jìn),康薇.湖北銅綠山古銅礦野生蓖麻重金屬含量研究[J].黃石理工學(xué)院學(xué)報(bào),2009,25(1):36-40.

[10] 康薇,鄭進(jìn).蓖麻(RicinuscommunisL.)—— 一種新的銅超積累植物[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(3):1449-1451,1466.

[11] 金勇,鄭進(jìn),康薇,等.蓖麻愈傷組織的誘導(dǎo)及其耐銅性研究[C]∥面向未來(lái)的土壤科學(xué)(中冊(cè))：中國(guó)土壤學(xué)會(huì)第十二次會(huì)員代表大會(huì)暨第九屆海峽兩岸土壤肥料學(xué)術(shù)交流研討會(huì)論文集,2012:745-746.

[12] 唐世榮.污染環(huán)境植物修復(fù)的原理與方法[M].北京:科學(xué)出版社,2006:41.

[13] 茅野充男.重金屬與生物[M].東京:博友社,1988:81.