利用熱帶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二元酸的研究進展

桂秋芬,姚嘉旻,蔣洋松,趙意平

(淮安清江石油化工有限責任公司，江蘇 淮安 223002)

長鏈二元酸(DCA)是指碳鏈上含有10個以上碳原子的脂肪族二元酸，是制造高級香料、高性能尼龍工程塑料、高檔尼龍熱熔膠、高溫電解質、高級潤滑劑、高級油漆和涂料、耐寒性增塑劑、樹脂、醫(yī)藥和農藥的重要原料[1-2]。長鏈二元酸不能從自然界直接獲取，多采用植物油裂解法或化學合成法制取，這兩種制備方法都存在很多弊端。20世紀70年代起，微生物發(fā)酵法以原料來源廣、反應專一性強、反應條件溫和等優(yōu)勢已成為綠色化學生物合成中一個重要的研究開發(fā)領域[3-5]。

長鏈二元酸發(fā)酵技術工業(yè)化應用始于20世紀末、本世紀初，我國和日本在此領域開展了大量工作。從1998年開始，我國在江蘇、山東、遼寧等地先后建立了6家生產(chǎn)企業(yè)[6]。長鏈二元酸發(fā)酵技術工業(yè)化應用方面的研究主要集中在以下3個方面:(1)長鏈二元酸產(chǎn)酸優(yōu)勢菌株的選育；(2)培養(yǎng)基組成的優(yōu)化和發(fā)酵工藝條件的調控；(3)長鏈二元酸后續(xù)提純工藝的選取與優(yōu)化。作者在此對這三方面的研究進展進行了綜述，并提出了有待進一步研究的問題。

1 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌株的選育

1.1 生產(chǎn)菌株來源

目前，國內二元酸生產(chǎn)企業(yè)工業(yè)化菌株主要來源于中國科學院微生物研究所、中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所、中國石化撫順石化研究院，這3家科研機構針對不同來源熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)菌已進行了數(shù)十年之久的艱辛研究工作。

1)中國科學院微生物所 20世紀70年代起，中國科學院微生物所在方心芳院士等的帶領下，開始從事微生物發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二元酸的基礎理論研究和微生物發(fā)酵正構烷烴生產(chǎn)長鏈二元酸的應用開發(fā)研究，目前發(fā)酵工業(yè)放大技術已成熟。據(jù)CN1928100A 報道利用CH-14-204菌株在50 m3發(fā)酵罐中發(fā)酵130 h，十二碳二元酸(DCA12)產(chǎn)酸量達145 g·L-1[7]。

2)中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所 20世紀70年代起，該所開展微生物發(fā)酵正十五烷烴生產(chǎn)十五碳二元酸(DCA15)的基礎理論和應用研究，發(fā)酵產(chǎn)酸水平接近72.5 g·L-1[8]，與中國科學院微生物所[3]水平相當。

3)中國石化撫順石化研究院 1987年，中國石化撫順石化研究院從中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所購取熱帶假絲酵母菌株，開展微生物發(fā)酵制備DCA12、十三碳二元酸(DCA13)的應用開發(fā)研究。其中熱帶假絲酵母突變株SP2UV256已用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)DCA13，培養(yǎng)6 d 的平均產(chǎn)酸量為156.5 g·L-1，而DCA12在10 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)6 d 的平均產(chǎn)酸量為170 g·L-1，但工業(yè)化應用報道較少[9]。

1.2 優(yōu)勢菌株的選育進展

1.2.1 熱帶假絲酵母代謝烷烴的途徑[10-12](圖1)

由圖1可以看出，熱帶假絲酵母代謝烷烴的途徑可分為5個步驟：(1)酵母細胞吸收烷烴并轉運至細胞內；(2)烷烴被P450酶系α-氧化成DCA12；(3)十二碳一元酸進一步被相同酶系ω-氧化成DCA12；(4)十二碳一元酸或DCA12被β-氧化成二氧化碳和水；(5)酵母細胞利用H+濃度梯度轉運DCA12，分泌至酵母細胞外。其中，步驟(2)、(3)是慢速反應過程，步驟(5)是快速反應過程。

圖1 熱帶假絲酵母烷烴代謝和糖代謝的途徑Fig.1 The metabolic pathway of paraffin and sugar for Candida tropicalis

結合代謝烷烴和碳水化合物消耗的途徑，高產(chǎn)熱帶假絲酵母菌株要求：(1)菌株的α，ω-氧化能力強，在蔗糖碳源中生長良好，產(chǎn)酸水平高；(2)菌株的β-氧化能力相對較弱，難以利用烷烴或同化烷烴生長，對產(chǎn)物DCA12降解能力差。

1.2.2 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌株選育研究進展

誘變育種是基于基因突變的菌種改良方法,其理論基礎是改變遺傳物質DNA的結構,從而使得傳代菌種在遺傳性狀上發(fā)生突變。20世紀90年代起，隨著基因工程技術、離子束生物技術的發(fā)展，構建β-氧化阻斷型菌株、低能離子束注入新興技術手段在菌種改造方面得以應用[13]。

1)理化因素誘變

目前，應用比較成功和常用的誘變方法有：(1)紫外線照射處理誘變。紫外誘變技術早在20世紀70年代即得到應用，日本礦業(yè)公司利用紫外誘變等手段篩選出熱帶假絲酵母菌變異株M2030，發(fā)酵120 h可產(chǎn)酸130 g·L-1[14]；趙興青[15]在篩選產(chǎn)DCA13菌株過程中采用蔗糖(唯一)碳源培養(yǎng)基、烷烴(唯一)碳源培養(yǎng)基、苯酚紅顯色培養(yǎng)基復合篩選假絲酵母菌株，并通過紫外誘變方法進一步提高優(yōu)勢菌株的產(chǎn)酸性能，取得了比較理想的搖瓶產(chǎn)酸效果；(2)亞硝酸鈉處理誘變。陳遠童等[16]在篩選Δ9-1,18-十八烯二元酸生產(chǎn)菌株過程中采用NaNO2誘變，也取得了比較好的產(chǎn)酸量；(3)亞硝基胍處理誘變。CN 1928100A[7]報道采用亞硝基胍作為化學誘變劑，篩選出高產(chǎn)假絲酵母菌CH-14-204，發(fā)酵139 h時產(chǎn)酸量為192.3 g·L-1；(4)多倍體誘變育種。沈永強等[17]用秋水仙堿和樟腦分別誘變菌株N-26產(chǎn)生多倍體細胞NPCO2和NPca18，其產(chǎn)生DCA15能力從出發(fā)菌株的10 g·L-1分別提高到17.3 g·L-1和18.3 g·L-1[17-18]；(5)復合誘變育種。CN95117436.3報道了一株高產(chǎn)長鏈二元酸的假絲酵母菌的篩選方法，先用硫酸二乙酯誘變假絲酵母菌，再利用紫外線二次誘變酵母細胞及氯丙嗪濃縮α,ω-氧化增強的假絲酵母菌，發(fā)酵130 h時產(chǎn)酸量為145 g·L-1，轉化率為90%[19]。

2)利用基因工程技術改造菌種

隨著分子生物學的進一步發(fā)展，基因工程技術也被用于構建長鏈二元酸生產(chǎn)菌株。美國Picataggio等用基因工程方法構建β-氧化阻斷型菌株H5343,在小型發(fā)酵罐中發(fā)酵n-C12生產(chǎn)DCA12,產(chǎn)酸水平從 95 g·L-1提高到140 g·L-1[5,20]。高弘等[20]構建了肉毒堿?；D移酶基因單拷貝缺失菌和雙拷貝缺失菌，并對基因重組菌的生長及產(chǎn)酸特性進行研究，發(fā)現(xiàn)肉毒堿?；D移酶基因雙拷貝缺失菌不能夠代謝烷烴。

基因工程菌易于退化，并存在某些問題，暫無工業(yè)化方法相關報道。

3)N+離子束注入誘變育種

陳祖華等[21]以熱帶假絲酵母SCB412作為出發(fā)菌株，經(jīng)能量為50 keV、劑量為1×1011～5×1015ion·cm-2的N+離子束注入誘變處理篩選獲得一株能夠利用n-C12生產(chǎn)DCA12的高產(chǎn)菌株，產(chǎn)酸量從43.5 g·L-1上升到73.2 g·L-1；楊艷裴[22]經(jīng)2次N+離子束注入對熱帶假絲酵母菌進行誘變，篩選到高產(chǎn)突變株，產(chǎn)酸量由29.77 g·L-1提高到73 g·L-1；CN 1928100A[7]報道通過硝基胍、亞硝酸、紫外線和N+離子束注入等多種誘變方法，篩選出高產(chǎn)假絲酵母菌CH-14-204，發(fā)酵139 h時產(chǎn)酸量為192.3 g·L-1，轉化率為88.8%。

1.3 國內生產(chǎn)企業(yè)在菌株選育方面的進展

隨著我國發(fā)酵法生產(chǎn)長鏈二元酸技術的突破，我國長鏈二元酸的產(chǎn)能已躍居世界第一。自1998年開始，借助中國科學院微生物所、中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所、中國石化撫順石化研究院3家科研機構的技術支持，我國在江蘇、山東、遼寧等地先后建立了6家生產(chǎn)企業(yè)[6]。CN 02145431.0[23]報道，凱賽生物公司于2002年誘變選育出一株熱帶假絲酵母突變菌株(CCTCCM 202042)，利用n-C14為底物發(fā)酵可獲得190 g·L-1十四碳二元酸(DCA14)；CN 1570124A[24]報道，凱賽生物公司誘變選育熱帶假絲酵母菌(CCTCC No.203052)，于2004年申報以C9～C18烷烴或脂肪酸為底物發(fā)酵生產(chǎn)正長鏈二元酸的方法；CN 1844404A[25]報道，南通圣諾鑫公司于2006年申報微生物發(fā)酵生產(chǎn)混合長鏈二元酸的方法；2009年山東瀚霖生物依托中國科學院微生物所發(fā)酵技術快速發(fā)展起來，并于2010年陸續(xù)申報CN 102010318A 、CN 201686632U、CN 101955424A等6項中國專利，主要涉及長鏈二元酸生物發(fā)酵生產(chǎn)裝置[26-28]。

綜上所述，建立合適的誘變育種方法，篩選出烷烴轉化率高、發(fā)酵周期短、產(chǎn)酸性能強、性能穩(wěn)定的優(yōu)良菌株，可有效降低長鏈二元酸生產(chǎn)成本，增強該類項目的競爭力與抗風險能力。

2 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.1 發(fā)酵模型

長鏈二元酸發(fā)酵過程屬非生長偶聯(lián)型發(fā)酵(Gaden-Ⅲ型發(fā)酵)[29]，即酵母菌增殖與二元酸產(chǎn)物積累之間無關聯(lián)，菌體增殖與產(chǎn)物代謝分兩步進行(圖2)：發(fā)酵前期，菌體大量繁殖，以其生長為主，pH值控制在3～5；發(fā)酵后期，菌體數(shù)量達到一定值后以菌體發(fā)酵產(chǎn)酸為主，pH值控制在6.5～7.5最佳[30]。

圖2 長鏈二元酸發(fā)酵曲線Fig.2 The fermentation curves of long chain dicarboxylic acid

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化進展

2.2.1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

長鏈二元酸發(fā)酵培養(yǎng)基需要碳源、氮源、生長必需的無機鹽及微量生長因子等。劉祖同等[31]研究表明，利用熱帶假絲酵母生產(chǎn)長鏈二元酸，尿素是最好的氮源；但沈永強等[32]研究發(fā)現(xiàn)，當尿素量過高時，不積累長鏈二元酸。除碳源、氮源外，種子培養(yǎng)基中還要有生長必需的無機物及微量生長因子，如磷酸鹽、氯化鈉、硫酸鎂、維生素、玉米漿以及酵母膏等。沈永強等[32]和許曉增等[14]還發(fā)現(xiàn)，磷酸二氫鈉含量為0.1%～0.2%、磷酸氫二鉀含量為0.4%～0.6%時利于長鏈二元酸積累；Mobley等[33]指出，酵母膏對增加酸產(chǎn)量必不可少，其最適量為0.05%～0.10%，超過此限度產(chǎn)酸量減少，鎂離子最小量為0.05%，如果鎂離子缺乏，酸產(chǎn)量下降約75%。

2.2.2 代謝途徑及相關酶系調控

獲得優(yōu)良生產(chǎn)菌株后，對發(fā)酵過程進行必要的代謝調控十分重要。經(jīng)誘變選育出來的高產(chǎn)菌株，其ω-氧化能力增強、β-氧化能力削弱，但β-氧化并沒有完全被阻斷(圖1)。因此，在發(fā)酵過程中必須進一步降低β-氧化酶活力、增強ω-氧化酶活力。

1)ω-氧化酶系調控

熱帶假絲酵母菌在烷烴代謝過程中的α，ω-氧化過程主要由細胞色素P450酶系(CYP)、醇氧化酶(FAO)和醛脫氫酶(FALDH)等催化完成，反應在細胞內的微粒體中發(fā)生[34]。

CYP是ω-氧化過程中的關鍵酶和限速酶，CYP酶活力的提高必然會提高細胞的產(chǎn)酸能力，例如：(1)在種子培養(yǎng)基中(或發(fā)酵的生長階段)加入烷烴可以誘導CYP酶活的提高。Bertrand等[35]發(fā)現(xiàn)CYP在以烷烴為底物時含量比以葡萄糖為底物時高出20倍。高濃度的烷烴條件下，雖然烷烴本身并不利于細胞的生長，但是卻促進了CYP的表達[35-36]；(2)在烷烴代謝過程中添加Fe3+可以提高CYP酶活力[35]；(3)青霉素的添加可改善細胞膜的滲透性，有助于ω-氧化能力增強[37]；(4)苯巴比妥是CYP的誘導劑，苯巴比妥類誘導劑可與CYP基因的阻礙蛋白結合[38]。王麗菊[39]在發(fā)酵12 h時添加0.5 g·L-1苯巴比妥能增強ω-氧化能力，但過量添加則會產(chǎn)生抑制作用；(5)過氧化氫酶體增殖劑 (PPARs)對CYP也有誘導作用。1996年，Ohtomo等[40]報道了過氧化氫增殖因子對低等真核生物麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)CYP的誘導作用；張劍等[41]指出H2O2能明顯提高產(chǎn)酸和CYP酶活，還可以提高ω-氧化酶活力。

2)β-氧化酶系調控

熱帶假絲酵母降解長鏈二元酸的β-氧化酶系包括?；o酶A氧化酶(ACO)、烯酰輔酶A水合酶、3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶、3-酮脂酰輔酶A硫解酶和乙酰輔酶A硫解酶，脂肪酸的β-氧化是降低烷烴轉化率的主要因素。相關的酶還包括?；o酶A合成酶、肉毒堿脂酰轉移酶等[42]。

在熱帶假絲酵母中，ACO是長鏈二元酸降解的限速酶，而β-氧化在過氧化物酶體中進行。脂肪酸β-氧化中間產(chǎn)酸[脂酰輔酶A，即HOOC-(CH2)n～SCOA]的轉運是β-氧化中的重要環(huán)節(jié)，這一環(huán)節(jié)中起關鍵作用的是肉毒堿脂酰轉移酶。研究表明，β-氧化酶系的調控方式主要有：(1)添加ACO抑制劑。丙烯酸是ACO的反競爭性抑制劑，添加量為0.05%～0.10%時有明顯促進作用，但用量超過0.2%時，反而不利于二元酸的積累[38]；維生素C是ACO的競爭性抑制劑，有強烈的抑制作用[43]，但維生素C具有酸性和較強的還原性，不利于長鏈二元酸的分泌；(2)添加金屬離子Ag+和Pb2+完全抑制ACO活性，添加Ba2+、Ca2+和Mg2+有明顯抑制作用；(3)添加非離子型表面活性劑對ACO有不同程度的抑制作用[43]；(4)利用基因工程技術阻斷β-氧化途徑。1998年，Picataggio等用基因工程方法，構建β-氧化阻斷型菌株H5343,在小型發(fā)酵罐中發(fā)酵n-C12生產(chǎn)DCA12,產(chǎn)酸水平從95 g·L-1提高到140 g·L-1[5,18]；2001年，Hara等[44]構建熱帶假絲酵母M1210A3，指出ACO的表達與長鏈二元酸產(chǎn)量沒有必然聯(lián)系，而酰基輔酶A合成酶表達量降低時，長鏈二元酸產(chǎn)量提高。

3)小分子效應物調控

近年來，人們又發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入產(chǎn)酸促進因子會提高產(chǎn)酸量。丙氨酸作為小分子有機酸，對微生物的TCA循環(huán)、過氧化氫酶活力和谷氨酸脫氫酶活力有影響，當其加入量為0.5%時，明顯促進DCA12的產(chǎn)生[45]；在雙底物發(fā)酵中加入醋酸鈉，可以提高DCA13產(chǎn)量和烴酸轉化率，原因可能是醋酸衍生物進入烷烴β-氧化的同化過程，提供細胞代謝所需要的碳源和能量，從而降低了產(chǎn)物DCA的降解，同時參與ω-氧化酶系的活性調節(jié)，促進DCA合成[46]。

2.2.3 發(fā)酵工藝調控

根據(jù)熱帶假絲酵母合成長鏈二元酸發(fā)酵體系的特點，發(fā)酵工藝中pH值、溶解氧、補料及轉發(fā)酵時間對發(fā)酵影響較大。

1)pH值控制

生產(chǎn)長鏈二元酸的熱帶假絲酵母，其菌體生長和產(chǎn)酸的最適pH值不相同，菌體生長的最適pH值為5.0左右，而產(chǎn)酸的最適pH值在7.8±0.2[15]。pH值對細胞分泌長鏈二元酸以及長鏈二元酸的溶解性影響較大，pH值過低或過高都不利于長鏈二元酸的分泌，pH值過高時抑制菌體活性，中性偏堿的環(huán)境利于ω-氧化、抑制β-氧化，但在產(chǎn)酸發(fā)酵末期，常利用提高pH值方式促進殘烴充分利用[14,47]。發(fā)酵過程中控制合理的pH值范圍，既有利于難溶于水的長鏈二元酸轉變成易溶于水的長鏈二元酸鹽，又有利于抑制β-氧化，從而提高產(chǎn)酸速率和長鏈二元酸的純度。

2)溶解氧控制

發(fā)酵液中溶解氧大小受通氣量、罐壓、攪拌速度的影響，且三種因素對溶解氧的影響大小為：攪拌速度>罐壓>通氣量。溶解氧不是越高越好，劉樹臣等[46，48]發(fā)現(xiàn)在DCA13發(fā)酵中加強攪拌混合效果和控制低溶解氧是穩(wěn)定提高長鏈二元酸產(chǎn)量的有效方法，在DCA12發(fā)酵中控制溶解氧水平在20%～30%最適于產(chǎn)酸，過高的溶解氧水平對提高產(chǎn)酸水平作用不明顯，反而增加能耗。

3)補料控制

對于發(fā)酵法生產(chǎn)長鏈二元酸的補料控制，文獻報道主要集中于雙底物正構烷烴和蔗糖。其中，起始烷烴濃度、分批補加烷烴的加入量和時間與產(chǎn)酸的關系密切。劉祖同等[31]以DCA13為例，起始烷烴濃度為15%、每隔48 h補加10%基質的產(chǎn)酸量比起始烷烴濃度為8%、每隔24 h流加5%基質的產(chǎn)酸量提高22%。趙興青[15]在菌體進入產(chǎn)酸期24 h、48 h、72 h時分別補加0.5%的蔗糖繼續(xù)發(fā)酵，48 h加0.5%蔗糖時產(chǎn)酸量提高效果最好，但補加烷烴和蔗糖都會延長發(fā)酵時間。

4)轉發(fā)酵時間控制

轉發(fā)酵時間的控制決定了發(fā)酵過程的產(chǎn)酸水平。佟明友等[49]在DCA13發(fā)酵中在線檢測參數(shù)DO、尾氣中O2含量和CO2含量與菌體濃度的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)當DO曲線降至低谷時，表明菌體的對數(shù)生長期即將結束，此時可以調節(jié)工藝條件轉入產(chǎn)酸階段。

3 提純工藝研究

3.1 發(fā)酵液預處理

發(fā)酵液是一個復雜的多相體系，其中含有未反應的烷烴、酵母碎片、殘留培養(yǎng)基、代謝產(chǎn)物以及微生物的分泌物等[50]。發(fā)酵終止后，將發(fā)酵液加熱、破乳，經(jīng)微濾膜過濾去除殘留烷烴層、乳化層、菌體層，可獲得澄清透亮的發(fā)酵清液即長鏈二元酸粗品，但存在單酸純度偏低、總氮和鐵離子含量偏高等問題，仍需進一步提純精制。

3.2 提純工藝進展

長鏈二元酸提純工藝主要有水相提純法、酯化提純法、醇溶結晶法、鹽析結晶法、溶劑精制法等。

1)水相提純法

水相提純法是用活性炭或超濾膜脫除發(fā)酵清液中部分色素、蛋白質及有機雜質等，再用濃H2SO4酸化結晶，冷卻、過濾，得到長鏈二元酸結晶，但純度<97.5%，色素含量仍比較高[14]。該法具有投資少、操作簡單、安全環(huán)保等優(yōu)點，但產(chǎn)品純度低、色澤差、晶體粒度不均勻、蛋白質及其它雜質含量高。要想獲得高質量產(chǎn)品，需進一步改進母液除雜與結晶控制的方法。

2)酯化提純法

酯化提純法對原料純度要求不高，是將長鏈二元酸粗品與低碳醇進行酯化反應、皂化水解、酸析結晶進行精制，長鏈二元酸純度可達99%以上。但該法存在醇加入量過高、反應時間長、能耗高等缺點，不適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，還需要進一步加以研究改進[51]。

3)醇溶結晶法

醇溶結晶法是將發(fā)酵液經(jīng)膜過濾除去菌體，活性炭脫色、酸化結晶、過濾，得到的濕濾餅溶解于加熱的C2～C5醇類(如乙醇、辛醇、C2～C5二元醇等)中，再經(jīng)活性炭脫色過濾，冷卻，結晶，得到長鏈二元酸純品。因常溫下醇類對長鏈二元酸溶解性比較高，該法存在溶液損失率>15%、產(chǎn)品損失率約10%、產(chǎn)品中殘留少量酯化物雜質、結晶顆粒細小等問題[52-53]。

4) 鹽析結晶法

鹽析結晶法是將發(fā)酵清液在堿性條件下加熱，加入鹽析劑，冷卻，將析出的長鏈二元酸鹽晶體再溶于熱水中，經(jīng)酸化結晶、分離干燥，得精制長鏈二元酸。該法存在酸損失較大、鹽析劑投入量高、產(chǎn)品純度可控性差等問題[18,53]。

5) 溶劑精制法

溶劑精制法是將發(fā)酵液經(jīng)膜過濾除去菌體、活性炭脫色、酸化結晶、過濾得到的長鏈二元酸粗品溶解于醋酸[24]、丙酮[53]、甲基異丁基酮[54]等與其不產(chǎn)生化學反應的有機溶劑中，再經(jīng)活性炭脫色、抽濾，濾液冷卻結晶，得白色長鏈二元酸結晶。該法具有產(chǎn)品純度高、色澤好、結晶顆粒大的優(yōu)點，可滿足聚合級產(chǎn)品質量的要求，但存在投資大、成本高、污染環(huán)境等問題。

4 結語

綜上所述，現(xiàn)階段長鏈二元酸生產(chǎn)菌的篩選仍主要通過傳統(tǒng)的誘變篩選方法尋找優(yōu)勢菌株，其效率低、工作量大，隨著新興基因工程技術的發(fā)展，如何利用基因工程技術高效篩選性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株將是后續(xù)研究的重點。選擇高效的β-氧化抑制劑和ω-氧化促進劑，以及通過發(fā)酵條件與設備的優(yōu)化進一步提高生產(chǎn)效率是發(fā)酵工藝優(yōu)化的主要方向。現(xiàn)有長鏈二元酸提純工藝方法各有優(yōu)缺點，如何組合它們的優(yōu)點建立易于操作、投入少、環(huán)保、產(chǎn)品純度高的提純工藝路線，也是需要進一步研究的課題。

[1] 任剛，陳遠童.十二碳二元酸的發(fā)酵研究[J].生物工程學報,2000,16(2):198-202.

[2] Picataggio S,Rohrer T,Deanda K,et al.Metabolic engineering ofCandidatropicalisfor the production of long-chain dicarboxylic acids[J].Nature Biotechnology,1992,10(8):894-898.

[3] 陳遠童，郝秀珍.熱帶假絲酵母的β-氧化及代謝控制研究[J].生物工程學報,1987,3(4):307-308.

[4] 陳遠童，郝秀珍.微生物發(fā)酵生產(chǎn)十一烷-1,11-二羧酸的研究[J].生物工程學報,1989,5(3):241-245.

[5] 陳遠童，郝秀珍，龐月川.十五碳二元酸的發(fā)酵研究[J].微生物學通報,1995,35(6):433-437.

[6] 陳遠童.十二碳二元酸工業(yè)生產(chǎn)試驗研究[J].微生物學通報,1998,25(4):244.

[7] 陳遠童，郝秀珍，徐軍.生物合成生產(chǎn)十二碳二元酸的新方法：中國，1928100A[P].2007-03-14.

[8] 沈永強，樓純菊，徐可仁，等.石油發(fā)酵長鏈二元酸的研究Ⅲ.熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)多倍體變種生產(chǎn)十三烷1∶13二羧酸的發(fā)酵條件研究[J].植物生理學報,1979,5(4):385-393.

[9] 劉樹臣，李淑蘭，楊東.十三碳二元酸發(fā)酵工業(yè)試驗[J].石油化工,2002,31(7):558-561.

[10] 許曉增，佟明友，李家鵬.長鏈十三碳二元酸發(fā)酵過程的動力學分析與模型初探[J].石油煉制與化工，1994,25(1):15-18.

[11] 張志禹，朱濤，林榮勝，等.熱帶假絲酵母的二元酸分泌現(xiàn)象及其動力學[J].清華大學學報 (自然科學版)，1999,39(12):27-30.

[12] 張志禹，朱濤，林榮勝，等.產(chǎn)長鏈二元酸熱帶假絲酵母酸分泌過程研究[J].微生物學雜志，1998,18(4):17-20.

[13] 陳遠童.生產(chǎn)長鏈二元酸菌株的誘變篩選[J].微生物學通報,2001,28(2):104.

[14] 許曉增，佟明友.長鏈二元酸發(fā)酵技術[J].現(xiàn)代化工，1996，16(1)：22-24.

[15] 趙興青.發(fā)酵法生產(chǎn)十三碳二元酸的試驗研究[D].沈陽：東北大學,2003.

[16] 陳遠童，龐月川，郝秀珍.△9-1,18-十八烯二元酸生產(chǎn)菌株的篩選和誘變[J].微生物學報，1997,37(1):65-67.

[17] 沈永強，樓純菊.石油發(fā)酵長鏈二元酸的研究[J].植物生理學報，1979,5(4):385-393.

[18] 唐如星.發(fā)酵法生產(chǎn)十三碳二元酸的初步研究[D].天津：天津科技大學,2001.

[19] 陳遠童，郝秀珍，方心芳.微生物同步發(fā)酵生產(chǎn)長鏈α,ω-二羧酸的方法:中國，95117436.3[P].1996-09-01.

[20] 高弘，李春，華玉濤，等.長鏈二元酸代謝中肉毒堿脂酰轉移酶的作用[J].中國生物工程雜志，2003，23(6)：14-16．

[21] 陳祖華，葉晴，尹光琳.N+離子注入熱帶假絲酵母對長鏈二元酸的影響[J].微生物學通報，2000,27(3):174-177.

[22] 楊艷斐．離子注入在發(fā)酵工業(yè)中的應用及研究N+離子注入熱帶假絲酵母菌對其十三碳二元酸產(chǎn)量的影響[D].天津:天津師范大學,2001．

[23] 陳遠童，衷金生，劉文鳳.一種利用微生物發(fā)酵高產(chǎn)α，ω-正長鏈十四碳二元酸的方法：中國，02145431.0[P].2004-04-09.

[24] 邱勇雋，李乃強，胡兵.一種正長鏈二元酸的生產(chǎn)方法：中國，1570124A[P].2005-01-26.

[25] 張肅靜，陳遠童.微生物發(fā)酵生產(chǎn)混合長鏈二元酸的方法：中國，1844404A[P].2006-10-11.

[26] 王志洲，曹務波，陳遠童.一種混合長碳鏈二元酸的生產(chǎn)方法：中國，102010318A[P].2011-04-13.

[27] 王志洲，曹務波，陳遠童.生物發(fā)酵法生產(chǎn)長碳鏈二元酸的精制生產(chǎn)裝置：中國，201686632U[P].2010-12-29.

[28] 王志洲，曹務波，陳遠童.長碳鏈二元酸精制生產(chǎn)過程溶劑回收裝置：中國，101955424A[P].2011-01-26.

[29] 山根恒夫.生物反應工程[M].上海:上?？萍汲霭嫔?1989.

[30] 加藤恒一，植村南海男．利用發(fā)酵法制造二元酸：日本，5611796A[P].1981-04-26.

[31] 劉祖同，高忠翔.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)二羧酸[J].石油學報(石油加工)，1989，5(2)：8-12.

[32] 沈永強，夏國興，樓純菊，等.石油發(fā)酵長鏈二元酸的研究(Ⅳ).熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)休止細胞轉化正烷烴為相應長鏈二元酸的研究[J].植物生理學報,1980，6(1)：29-35.

[33] Mobley D P，Shank G K．Fermentation medium and method for producingα,ω-alkanedicarboxylic acids：美國，6004784[P].1999-12-21．

[34] Cheng Q，Sanglard D，Vanhanen S，et al．Candida yeast long cha-in fatty alcohol oxidase is a span class="emphasis_italic">c-type haemoprotein and plays all important role in long chain fatty acid metabolism[J]．Biochimica et Biophyrsica Acta，2005,1735(3)：192-203.

[35] Bertrand J C，Bazin H，Zacek M，et al．NADPH-Cytochromecreductase ofCandidatropicalisgrown on alkane[J]．Eur J Biochem,1979,93(2)：237-243．

[36] 焦鵬，華玉濤，李書良，等．熱帶假絲酵母轉化烷烴過程中P450酶活的研究[J]．微生物學報，2001，41(1)：117-120.

[37] 冷欣夫，邱星輝．細胞色素P450酶系的結構、功能和應用前景[M]．北京：科學出版社，2001：189-198．

[38] 陳遠童.微生物發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二元酸的代謝調控[J].微生物學通報,2001,28(3):102.

[39] 王麗菊.發(fā)酵法生產(chǎn)十五碳二元酸[D].無錫:江南大學,2008．

[40] Ohtomo R，Kebayashi K，Muraoka S I，et al．Peroxisome proliferators activate cytochrome P450 genes in all alkane-assimilation yeast，Candidamaltosa[J]．Biochemical and Biophysical Research Communications，1996,222(3):790-793．

[41] 張劍，李春，高弘,等.H2O2對熱帶假絲酵母醇氧化酶的影響及其作用機理分析[J].中國生物工程雜志,2004,24(1):62-65.

[42] Kawamoto S,Nozaki C,Tanaka A,et al.Fatty acidβ-oxidation system in microbodies ofn-alkane-grownCandidatropicalis[J].Eur J Biochem,1978,83(2):609-613.

[43] 歐陽晶，榮東，郝秀珍，等.熱帶假絲酵母酰基輔酶A氧化酶的純化及性質研究[J].微生物學報,2002,42(6):713-719.

[44] Hara A，Ueda M，Matsui T，et al．Repression of fatty-acyl-CoA oxidase-encoding gene expression is not necessarily a determinant of high-level production of dicarboxylic acids in industrial dicarboxylic-acid-producingCandidatropicalis[J]．Appl Microbiol Biotechnol，2001,56(3-4)：478-485．

[45] Sacha F，Simone D，Carlo W T，et al．Identification of the peroxisomalβ-oxidation enzymes involved in the degradation of long-chain dicarboxylic acids[J]．Journal of Lipid Research，2004,45(6):1104-1111.

[46] 劉樹臣，李淑蘭，方向晨.十三碳二元羧酸發(fā)酵技術的研究[J].微生物學報,2000,40(3):318-321.

[47] Lin R,Cao Z,Zhu T,et al．Secretion in long-chain dicarboxylic acid fermentation[J].Bioprocess Engineering,2000,22(5)：391-396．

[48] 劉樹臣，李淑蘭，金平,等．十二碳二元酸發(fā)酵研究[J]．微生物學報，2002，42(6)：748-780．

[49] 佟明友，嚴益民，楊東,等．長鏈二元酸生產(chǎn)過程中菌體生長轉發(fā)酵時間的判斷[J]．石油煉制與化工，2001，32(8)：19-21．

[50] 李占朝.十二碳二元酸的精制工藝研究[D].北京：北京化工大學，2009.

[51] 解麗娟，張艷麗，王崇暉．十三碳二元酸的精制方法[J]．精細與專用化學品，2002，10(20)：13-14.

[52] 王崇暉，佟明友，宋喜軍.提取精制生物發(fā)酵液中長鏈二羧酸的方法：中國，135005A[P].2002-05-29.

[53] 劉其永，廖金玉，楊光耀.碳11～18長鏈二元酸精制方法：中國，1410408A[P].2003-04-16.

[54] 劉樹臣，彭永成，張建剛.一種精制長鏈二元酸的方法：中國，1219530A[P].1999-06-16.