分光光度法測(cè)定一級(jí)大豆油色澤的研究

付元元，畢艷蘭，彭 丹，譚丹丹，孫尚德，劉 偉

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

色澤是評(píng)價(jià)食用油質(zhì)量的指標(biāo)之一，它直接影響油脂的外觀.油脂色澤受多種因素影響，如油料種類、產(chǎn)地、色素種類與含量、儲(chǔ)存環(huán)境、精煉程度等對(duì)其均有影響[1].目前色澤的測(cè)定采用羅維朋比色法，主要依靠人的視覺判斷來完成，故結(jié)果易受測(cè)試人員主觀因素的影響，誤差較大.

自20 世紀(jì)40 年代末就有人提出以分光光度法代替羅維朋比色法[2].Wan 等[3]對(duì)比了羅維朋目視比色法與自動(dòng)比色法對(duì)精煉棉籽油的測(cè)定效果，判定系數(shù)r2為0.99.Santana 等[4]對(duì)生物柴油的ASTM 顏色值與透光率進(jìn)行了研究，得出二次回歸方程為：y=4.307×10-5x2-4.545×10-2x+9.622，r2達(dá)0.999 7，其中y 為ASTM 顏色值，x 為400～700 nm之間透光率面積.孫鳳霞等[5]研究了圖像處理紅值與羅維朋紅值的關(guān)系，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好.我國國標(biāo)規(guī)定羅維朋比色法為測(cè)定油脂色澤的標(biāo)準(zhǔn)方法[6]，但需要有經(jīng)驗(yàn)的操作者來測(cè)定.霍權(quán)恭等[7]、鐘海雁等[8]根據(jù)羅維朋紅片的最大吸收波長535 nm，研究羅維朋紅值與菜籽油、芝麻油等在此波長處吸光度的關(guān)系，r2均在0.9 以上，但羅維朋紅片的特征吸收波長并不一定與所研究油脂的最大吸收峰波長一致.吳婧等[9]研究了羅維朋比色法和分光光度法對(duì)茶葉籽油色澤測(cè)定的差異，得出羅維朋比色法只適于常規(guī)檢測(cè)，精確檢測(cè)茶葉籽油中色素含量可采用640～690 nm 內(nèi)每納米吸光度之和來表示，r2可達(dá)0.936 4.

這些研究均是以紅值的特征吸收波長為基礎(chǔ)，研究的油脂顏色較深，對(duì)于淺色油則未必可行.至今沒有人研究羅維朋黃值與分光光度法的關(guān)系，這是因?yàn)槿舨还潭S值，將有黃、紅兩個(gè)變量，難以控制.但由于油脂本身底色不一，固定黃值得到的紅值與油脂的真實(shí)色澤相差較大.本研究采用色澤較淺的一級(jí)大豆油，研究了分光光度法與羅維朋比色法在固定黃值與不固定黃值時(shí)的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

由河南陽光油脂集團(tuán)下屬的3 個(gè)加工廠提供的不同批次一級(jí)大豆油16 種；于當(dāng)?shù)爻匈徺I不同廠家生產(chǎn)的一級(jí)大豆油6 種；由深色一級(jí)大豆油與購買的一級(jí)大豆油隨機(jī)配制38 種（其中由133.4 mm 比色槽測(cè)定羅維朋值最高為黃20 紅2.0，其余37 種均低于此值；國標(biāo)規(guī)定133.4 mm 比色槽測(cè)定一級(jí)大豆油的羅維朋值為：黃≤20，紅≤2.0）.

1.2 儀器與試劑

TINTOMETER MODEL E 羅維朋比色計(jì)：英國；WSL-2 比較測(cè)色儀：上海易測(cè)儀器設(shè)備有限公司；TU1810 紫外-可見分光光度計(jì)、T6 新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司.

無水乙醚（分析純）：洛陽市化學(xué)試劑廠.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羅維朋比色法[6]

將羅維朋比色計(jì)接通電源，用無水乙醚將133.4 mm 比色槽清洗干凈，將待測(cè)大豆油倒入槽內(nèi)約2/3 高度處，檢查油內(nèi)無氣泡，澄清透明即可測(cè)定.每個(gè)油樣由兩人測(cè)定，差別太大時(shí)由第3 人測(cè)定，選擇兩組最相近數(shù)據(jù)的平均值作為最終結(jié)果.

固定黃值調(diào)節(jié)：為避免黃值固定較大而影響紅值的測(cè)定，選擇顏色較淺的大豆油的黃值作為定值，調(diào)節(jié)其他一級(jí)大豆油的紅值，使兩邊顏色一致或最接近，記錄結(jié)果.

不固定黃值調(diào)節(jié)：自由調(diào)節(jié)黃值和紅值，直至顏色與油樣色澤一致或最接近，記錄結(jié)果.

1.3.2 分光光度法

打開電腦和紫外-可見分光光度計(jì)開關(guān)，預(yù)熱30 min 左右，打開軟件，開機(jī)自檢成功后，設(shè)置波譜掃描參數(shù)，波長范圍為400～800 nm，間隔1 nm，掃描速度為快速.以蒸餾水做參比進(jìn)行基線校正，再將待測(cè)油樣移入1 cm 玻璃槽內(nèi)約2/3 高度處掃描.每次掃描前應(yīng)用無水乙醚將比色槽清洗干凈.各油樣均取樣兩次掃描，掃描完成后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，模擬掃描曲線，在特定波段內(nèi)積分.

1.3.3 積分方法

將任意相鄰納米之間的圖形近似看作是一個(gè)梯形，則梯形區(qū)域的面積為（Ai＋Ai＋1）/2，其中i=400，401，…，799，Ai為i nm 處吸光度值，Ai+1為（i+1）nm 處吸光度值，1 為掃描間隔1 nm；那么400～800 nm 吸光度區(qū)域面積為

2 結(jié)果與討論

2.1 誤差分析

（1）不同測(cè)試人員使用同一臺(tái)TINTOMETER MODEL E 羅維朋比色計(jì)，測(cè)定同一種大豆油的結(jié)果見表1.

由表1 可知，不同測(cè)試人員使用同一臺(tái)羅維朋比色計(jì)對(duì)同一種大豆油的測(cè)定結(jié)果相差較大.不固定黃值時(shí)，黃值相差最高可達(dá)14.6，標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.5，紅值偏差為0.1；而固定黃值時(shí)，紅值相差可達(dá)0.6，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3.

表1 不同測(cè)試人員測(cè)定同一種大豆油的結(jié)果比較

（2）羅維朋比色計(jì)（英國）與比較測(cè)色儀（上海）對(duì)同一種大豆油的色澤測(cè)定結(jié)果見表2.

表2 不同比色計(jì)測(cè)定同一種大豆油的結(jié)果比較

由表2 可知，不同的比色計(jì)測(cè)定同一種大豆油偏差也較大，不固定黃值時(shí)黃值標(biāo)準(zhǔn)偏差可達(dá)3.5，紅值標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1，固定黃值時(shí)紅值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1.

（3）TU1810 紫外-可見分光光度計(jì)與T6 新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)掃描同一種大豆油，對(duì)430～480 nm 之間吸光度積分結(jié)果見表3.

表3 不同分光光度計(jì)對(duì)同一種大豆油兩次測(cè)定結(jié)果比較

由表1 和表2 可知，比色法的測(cè)定依靠視覺判斷，受人的主觀因素影響，故誤差較大，此外儀器的影響也不可忽視.由表3 可知，分光光度法的測(cè)定結(jié)果受主觀影響較小，標(biāo)準(zhǔn)偏差只有0.096，不同分光光度計(jì)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差也只有0.226，結(jié)果穩(wěn)定.分光光度法測(cè)定大豆油色澤產(chǎn)生的誤差主要與儀器本身有關(guān)，可基本排除人為因素的干擾，即使采用不同的分光光度計(jì)，誤差也很小.所以羅維朋比色法的測(cè)定結(jié)果遠(yuǎn)不如分光光度法的測(cè)定結(jié)果可信.

2.2 羅維朋比色法的測(cè)定結(jié)果分析

采用1.3.1 中的調(diào)節(jié)方法，對(duì)于顏色較淺的27種一級(jí)大豆油，固定黃值為3，對(duì)于顏色較深的33種一級(jí)大豆油，固定黃值為10 時(shí)，兩邊色片的顏色較為滿意.

由2.1 中的誤差分析可知，羅維朋比色法測(cè)定的結(jié)果誤差較大，在不同測(cè)試者、不同測(cè)試儀器之間均存在較大誤差，因此若將色差過大的一級(jí)大豆油的黃值固定為同一水平，較大的黃值會(huì)掩蓋淺色油的紅值，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏離真實(shí)顏色.相比之下，黃、紅均不固定時(shí)的測(cè)定結(jié)果可在一定程度上避免這種情況.

由黃值和紅值的分布（圖1）可以發(fā)現(xiàn)：一級(jí)大豆油以黃色變化為主，黃值越大，紅值的分布越寬.并且可以初步確定，自由測(cè)定黃值和紅值的結(jié)果滿足關(guān)系：0≤R≤0.1Y（Y 為黃值，R 為紅值）.綜合以上兩種分析結(jié)果，一級(jí)大豆油的羅維朋值不會(huì)出現(xiàn)黃值很小、紅值很大的情況.

圖1 一級(jí)大豆油的黃、紅值分布圖

2.3 分光光度法的測(cè)定結(jié)果分析

大豆油的顏色主要與其含有的色素種類、含量、加工方法、精煉程度有關(guān)，所以不同等級(jí)、不同品種的大豆油掃描波譜不同.在400～800 nm 波長內(nèi)掃描不同顏色的一級(jí)大豆油波譜如圖2 所示.

由圖2 可知，在可見光范圍內(nèi)，一級(jí)大豆油的吸收波譜為平滑的曲線，基本沒有特征吸收峰，只有極少數(shù)大豆油的譜圖在羅維朋黃片特征吸收波長635 nm[7]左右有一小峰，但非常不明顯；而無論是在羅維朋紅片的特征吸收波長535 nm[7-8]處還是在紅色最大吸收波長669 nm 處[9]均沒有吸收峰，所以對(duì)于一級(jí)大豆油，研究黃值或紅值的特定吸收波長并沒有太大意義.而譜圖趨勢(shì)顯示，在400～500 nm 之間，隨大豆油顏色加深，吸光度逐漸增大，說明大豆油色澤與其吸光度的確呈現(xiàn)一定關(guān)系.

一級(jí)大豆油呈色的原因有很多，類胡蘿卜素、葉黃素等的殘留，色原體的氧化，游離脂肪酸本身的顏色等[10]都會(huì)影響油脂的色澤，在可見光區(qū)有吸收的是類胡蘿卜素及葉黃素，而這些色素主要吸收430～480 nm 的藍(lán)紫光[11]，精煉后的一級(jí)大豆油中色素含量雖少，但卻是決定大豆油色澤的關(guān)鍵因素，而其他的影響因素如加工方式、精煉程度等并不能徹底去除這些色素.所以，本實(shí)驗(yàn)主要研究類胡蘿卜素及其衍生物的吸收波段430～480 nm和全波段400～800 nm 范圍內(nèi)的積分面積與羅維朋值的關(guān)系.

2.4 羅維朋值與分光光度法的關(guān)系

2.4.1 固定黃值測(cè)定的紅值與分光光度法的關(guān)系

研究黃值特征吸收波長635 nm、紅值特征吸收波長535 nm 處吸光度值與羅維朋值的回歸關(guān)系發(fā)現(xiàn)，兩者之間并無規(guī)律可循，r2＜0.35，相比之下，全波段與430～480 nm 之間的積分面積與羅維朋值的回歸效果較好.

（1）對(duì)于淺色一級(jí)大豆油，固定黃值為3，羅維朋紅值與全波段積分面積關(guān)系見圖3.

羅維朋紅值與430～480 nm 積分面積的回歸關(guān)系見圖4.

由圖3、圖4 可知，對(duì)于色澤較淺的一級(jí)大豆油，羅維朋紅值與全波段積分面積之間的回歸效果很不好，而與430～480 nm 之間的積分面積線性關(guān)系稍好，r2接近0.8.造成這種現(xiàn)象的原因有兩點(diǎn)：一方面是因?yàn)榱_維朋比色計(jì)本身誤差所致，再者油脂顏色普遍較淺，羅維朋比色計(jì)對(duì)于細(xì)小的顏色差別無法區(qū)分，使得測(cè)定誤差更大，這一現(xiàn)象與有關(guān)報(bào)道[2]增大光程可減小誤差的結(jié)論一致；另一方面，400～800 nm 的積分范圍過寬，無法排除其他影響吸光度大小的因素，導(dǎo)致積分結(jié)果帶有一定的盲目性.

圖3 黃值固定為3，大豆油羅維朋紅值與400～800 nm 積分面積的關(guān)系

圖4 黃值固定為3，大豆油的羅維朋紅值與430～480 nm 積分面積的回歸關(guān)系

（2）對(duì)于顏色相對(duì)較深的一級(jí)大豆油，固定黃值為10，羅維朋紅值與全波段積分面積關(guān)系的回歸結(jié)果見圖5.

圖5 黃值固定為10，大豆油的羅維朋紅值與400～800 nm 積分面積的關(guān)系

羅維朋紅值與430～480 nm 積分面積的回歸結(jié)果見圖6.

對(duì)比圖5 和圖6，兩個(gè)積分區(qū)域與羅維朋紅值的線性回歸效果均好于淺色一級(jí)大豆油，二次多項(xiàng)式的回歸效果更理想，相關(guān)系數(shù)均比淺色一級(jí)油高.但很明顯選擇430～480 nm 積分波段的回歸效果要優(yōu)于全波段，r2可達(dá)0.944 7.這是因?yàn)榇蠖褂偷念伾缴?，視覺差異就越大，從而提高了羅維朋值的準(zhǔn)確性，即大豆油中含的類胡蘿卜素及其衍生物等色素越多，區(qū)分效果就越明顯.所以羅維朋比色計(jì)適合測(cè)定深色一級(jí)大豆油，而分光光度法對(duì)大豆油色澤沒有要求，應(yīng)用更廣泛.

圖6 黃值固定為10，大豆油的羅維朋紅值與430～480 nm 積分面積關(guān)系

2.4.2 不固定黃值測(cè)定的黃值、紅值與分光光度法的關(guān)系

黃值和紅值均非定值，共3 個(gè)變量，所以將其與積分面積繪制成帶有等高線的3D 圖，通過曲面模型得出三者之間的關(guān)系.

一級(jí)大豆油的羅維朋黃值、紅值與400～800 nm 波段積分面積的關(guān)系如圖7 所示.

一級(jí)大豆油的羅維朋黃值、紅值與430～480 nm 波段積分面積的關(guān)系如圖8 所示.

圖7 一級(jí)大豆油的黃、紅值與400～800 nm 積分面積3D 圖

將底面投影圖按積分面積大小劃分為5 個(gè)區(qū)域，分別以S1、S2、S3、S4、S5表示，各區(qū)域的分布如圖9 所示.

對(duì)比圖7 與圖8，羅維朋黃值、紅值與全波段積分值的總體效果較差，而與430～480 nm 之間的積分面積在空間內(nèi)基本呈現(xiàn)良好趨勢(shì)，近似為一張平滑曲面，與固定黃值的回歸效果一致.由3D 圖也可以發(fā)現(xiàn)，一級(jí)大豆油的羅維朋值主要分布在R-0.1Y≤0 內(nèi)（R 代表紅值，Y 代表黃值），即自由調(diào)節(jié)黃、紅色時(shí)，一級(jí)大豆油的羅維朋色澤滿足條件0≤R≤0.1Y，此結(jié)論與在測(cè)定過程中的規(guī)律一致.

圖8 一級(jí)大豆油的黃、紅值與430～480 nm 積分面積3D 圖

圖9 一級(jí)大豆油在430～480 nm 間積分面積的底面分布圖

圖8、圖9 中等高線代表不同色澤的一級(jí)大豆油在430～480 nm 間積分面積的分布等級(jí)，按積分面積在底面投影劃分大豆油色澤等級(jí)的效果更明顯，等級(jí)大小可以根據(jù)需要自由確定，同一條等高線上的積分面積相同，即代表同一色澤的油脂.根據(jù)等高線的分布可知，積分面積隨羅維朋值增大呈上升趨勢(shì)，所以即使大豆油有微小色差，也可以進(jìn)行區(qū)分.根據(jù)圖9，一級(jí)大豆油在430～480 nm 之間的積分面積主要分為5 個(gè)等級(jí)，與羅維朋值的對(duì)應(yīng)關(guān)系如表4 所示.

統(tǒng)計(jì)表明，來自工廠的一級(jí)大豆油共22 份，全部分布在S2、S3區(qū)，其中S2占95.5%，S3占4.5%.大型工廠加工的一級(jí)大豆油色澤普遍較淺，在S1區(qū)域（S430～480nm≤1.1）沒有分布，若是改變加工水平，大豆油的色澤可進(jìn)一步降低，甚至達(dá)到化妝品用油的加工要求[12].而國標(biāo)（GB 1535-2003）規(guī)定的一級(jí)大豆油色澤的臨界值位于S5內(nèi)（S430～480nm=13），說明目前一級(jí)大豆油的色澤遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)，這意味著目前大豆油的加工水平很高，甚至個(gè)別項(xiàng)目處于過度加工狀態(tài)，考慮到出廠后的大豆油在儲(chǔ)存中色澤就可能發(fā)生改變，所以對(duì)于油脂的加工，工廠應(yīng)做到既要符合標(biāo)準(zhǔn)，又要節(jié)約資源，使經(jīng)濟(jì)效益最大化.因此，本研究的劃分區(qū)域合理.

表4 430～480 nm積分面積與羅維朋值對(duì)應(yīng)關(guān)系

從表4 可以看出，5 個(gè)色澤區(qū)域?qū)?yīng)的羅維朋值范圍有交叉，即羅維朋比色法不能將有微小色差的大豆油分開，依據(jù)積分面積區(qū)分的效果非常明顯，同時(shí)避免了因操作者不同對(duì)同一大豆油測(cè)出多組黃、紅值的情況.

通過上述分析可知，采用分光光度法測(cè)定大豆油色澤的效果要優(yōu)于羅維朋比色法.所以，對(duì)于整體色澤較淺的一級(jí)大豆油，可以采用分光光度法在430～480 nm 之間的掃描面積表示油脂色澤，從而排除應(yīng)用羅維朋比色計(jì)測(cè)定時(shí)的人為操作誤差以及由于顏色過淺而造成的視覺誤差，得到更準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果.

3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由市場(chǎng)隨機(jī)選取一級(jí)大豆油5 份，羅維朋值均滿足：0≤Y≤20，0≤R≤2.5 份一級(jí)大豆油在430～480 nm 之間的積分面積與羅維朋黃值、紅值如表5 所示.

通過對(duì)比可知，不固定黃值時(shí)，1～4 號(hào)預(yù)測(cè)的黃值、紅值均在S2區(qū)域，5 號(hào)處于S3區(qū)域，但4 號(hào)和5 號(hào)的實(shí)測(cè)羅維朋值分別在S3、S4區(qū)域.根據(jù)本研究建立的3D 模型可知1～5 號(hào)的預(yù)測(cè)黃值為3.618、8.643、3.920、11.357、16.683，預(yù) 測(cè) 紅 值 為0.1、0、0.1、0、0.3，統(tǒng)計(jì)分析顯示，5 個(gè)大豆油的預(yù)測(cè)黃值與實(shí)測(cè)黃值、預(yù)測(cè)紅值與實(shí)測(cè)紅值的差異均不顯著（將羅維朋比色法本身較大的誤差考慮在內(nèi)）.固定黃值為3 時(shí)，由S430～480=4.994R+1.180 得出的紅值與測(cè)定的紅值、固定黃值為10 時(shí)，由S430～480=6.049R+1.474 得出的紅值與測(cè)定的紅值、由S430～480=2.279R2+2.204R+2.757 得 出 的 紅 值 與 測(cè) 定的紅值經(jīng)分析也均無顯著差異.由此可知，根據(jù)研究結(jié)論得出的計(jì)算值與實(shí)際測(cè)定值具有很好的一致性，總體結(jié)果較為客觀、穩(wěn)定.驗(yàn)證試驗(yàn)表明市售一級(jí)大豆油基本符合上述關(guān)系，本結(jié)論可以用于測(cè)定不同廠家、不同批次生產(chǎn)的一級(jí)大豆油色澤.

表5 分光光度法與羅維朋黃、紅值對(duì)比

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)一級(jí)大豆油，研究了分光光度法與羅維朋比色法在固定黃值與不固定黃值兩種情況下的關(guān)系，并通過繪制3D 圖得到分光光度法在430～480 nm 之間掃描面積與羅維朋黃、紅值的對(duì)應(yīng)關(guān)系.

（1）分光光度法對(duì)一級(jí)大豆油的測(cè)定結(jié)果優(yōu)于羅維朋比色法，受操作人員主觀因素影響小，準(zhǔn)確性高.對(duì)同一種色澤的大豆油，分光光度法的測(cè)定結(jié)果唯一，可避免羅維朋比色法因操作者不同造成的較大誤差.

（2）對(duì)于色澤較淺（0≤Y＜10）的一級(jí)大豆油，采用公式S430～480=4.994R+1.180，r2=0.789 0；對(duì)于色澤較深（10≤Y≤20）的一級(jí)大豆油，采用公式S430～480=6.049R +1.474，r2=0.922 9 或 S430～480=2.279R2+2.204R+2.757，r2=0.944 7，由430～480 nm之間吸光度與X 軸圍成的面積表示油脂的色澤大小.

（3）一級(jí)大豆油在430～480 nm 之間的吸光度值和X 軸所圍面積S430～480與羅維朋黃值、紅值的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：0≤S430～480≤1.1 時(shí)，0≤Y≤3，0≤R≤0.3；1.1 ≤S430～480≤3.5 時(shí)，3 ≤Y ≤10，0 ≤R ≤0.5；3.5 ≤S430～480≤4.3 時(shí)，10 ≤Y ≤20，0 ≤R ≤0.7；4.3 ≤S430～480≤7.5 時(shí)，7 ≤Y ≤20，0 ≤R ≤1.1；7.5≤S430～480≤13 時(shí)，5≤Y≤20，0.9≤R≤2.0.根據(jù)上述對(duì)應(yīng)關(guān)系，已知一級(jí)大豆油在430～480 nm 之間的積分面積，就可基本確定黃值和紅值的范圍.

本研究因取樣數(shù)量少、地域所限不能完全覆蓋一級(jí)大豆油的色澤，人為的操作誤差也會(huì)在一定程度上影響3D 圖的表達(dá)效果.后續(xù)研究可擴(kuò)大取樣的數(shù)量，按油脂種類、等級(jí)進(jìn)行進(jìn)一步研究，還可根據(jù)需要自行劃分積分面積增量，或建立積分面積、黃值、紅值之間的標(biāo)準(zhǔn)3D 模型，得出三者對(duì)應(yīng)的具體數(shù)值，從而使分光光度法在油脂色澤的測(cè)定中發(fā)揮更大的作用.

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