高地芽孢桿菌堿性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究

李 文，陳復(fù)生*，丁長(zhǎng)河，李盤欣

（1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南南街村集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，河南 漯河 462699）

0 引言

堿性蛋白酶是一類最適pH 值偏堿性、適用于在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的蛋白酶，是一類非常重要的工業(yè)用酶，因其具有較強(qiáng)的水解能力、耐堿和耐熱能力，在食品、洗滌劑和絲綢、皮革制造業(yè)等中都發(fā)揮了巨大作用[1-3].大部分堿性蛋白酶的最適pH 值為9～11，少數(shù)蛋白酶的最適pH 值更高，如克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）GMBE 22所產(chǎn)蛋白酶的最適pH 值為12[4].堿性蛋白酶的最適溫度范圍較廣，由黃海底泥分離得到一株能夠穩(wěn)定高產(chǎn)蛋白酶菌株HW08，所產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的最適作用溫度為30 ℃[5]，而分離自嗜堿芽孢桿菌（Bacillus sp）B18 所產(chǎn)蛋白酶最適溫度可以達(dá)到85 ℃[6].同時(shí)研究表明一些金屬離子對(duì)堿性蛋白酶的活力有促進(jìn)或抑制的作用，在對(duì)地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）彈性蛋白酶的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度金屬離子Ca2+和K+對(duì)其酶活力有促進(jìn)作用，而Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+對(duì)其酶活力具有抑制作用[7].本實(shí)驗(yàn)室前期篩選了一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株，經(jīng)鑒定為高地芽孢桿菌PY41[8]，并進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)高地芽孢桿菌所產(chǎn)堿性蛋白酶進(jìn)行了分離與純化，通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳驗(yàn)證，得出該堿性蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量為29 500.而對(duì)該菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶性質(zhì)的研究在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，故作者對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為其在食品及其他行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：高地芽孢桿菌PY41，本實(shí)驗(yàn)室自篩菌株.

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：豆粕60、磷酸銨12、葡萄糖15、乳 糖 40、KCl 0.3、CaCl20.7、MgSO4·7H2O 0.2、pH 10[8].

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C 型pH 計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；TGL-16G 型臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-7504 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 酶活力測(cè)定

采用Folin-酚法[9].取1 mL 酶液40 ℃預(yù)熱2 min，加入預(yù)熱5 min 的1 mL 1%酪蛋白溶液中，在40 ℃水浴中反應(yīng)10 min.再加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸，在40 ℃水浴中反應(yīng)10 min，7 000 r/min離心10 min，取上清液.加入5 mL 0.4 mol/L Na2CO3中，再加入1.00 mL Folin 試劑混合均勻，在40 ℃水浴中顯色20 min.空白對(duì)照中加入酪蛋白和三氯乙酸的順序不同，其他相同.在680 nm 下測(cè)定吸光度值并計(jì)算酶活.

1.3.2 堿性蛋白酶最適反應(yīng)pH 和pH 穩(wěn)定性的研究

配制0.5 mol/L 的pH 4～6 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 7、pH 8、pH 8.5 的Tris-HCl 緩沖液，pH 9、pH 9.5、pH 10 的Gly-NaOH 緩沖液，pH 11、pH 12 的Na2HPO4-NaOH 緩沖液.用緩沖液分別稀釋純化后的酶液至一定倍數(shù)，并用該緩沖液配制1 %的酪蛋白溶液.在50 ℃條件下，測(cè)定不同pH值的堿性蛋白酶活力.同時(shí)將不同pH 值的酶液在50 ℃恒溫水浴下保溫30 min，測(cè)定堿性蛋白酶活力.

1.3.3 堿性蛋白酶最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性的研究

在pH 9.5 的條件下，測(cè)定堿性蛋白酶在20℃、30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、70 ℃恒溫水浴下的酶活力.同時(shí)將該酶液分別置于40℃、50 ℃、60 ℃恒溫水浴下保溫1 h，測(cè)定該酶活力.

1.3.4 金屬離子、EDTA 和SDS 對(duì)堿性蛋白酶酶活力的影響

配制含有Mn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+、Na+、Zn2+金屬離子和EDTA、SDS 的緩沖液，分別用上述緩沖液稀釋酶液，至終濃度為5 mmol/L[10].按照測(cè)定堿性蛋白酶酶活的方法測(cè)定酶活，以不加入上述緩沖液的蛋白酶酶活力為100%.

1.3.5 堿性蛋白酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定[11]

配 制 濃 度 為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、6 mg/mL、10 mg/mL，pH 為9.5 的酪蛋白溶液，取1 mL 不同濃度的酶液與稀釋到一定濃度的蛋白酶液在50 ℃時(shí)反應(yīng)10 min，用Folin 法測(cè)活力，根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法，得出Km值和vmax.

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 對(duì)堿性蛋白酶活力的影響

pH 值對(duì)堿性蛋白酶酶活力的影響如圖1 所示.在pH 值為5.0、6.0、12.0 時(shí)堿性蛋白酶相對(duì)酶活較低，均在15%以下.當(dāng)pH 值小于9.5 時(shí)，蛋白酶酶活力隨著pH 值的升高而升高；當(dāng)pH 值大于9.5 時(shí)，蛋白酶酶活力隨著pH 值的升高而降低.在pH 值為7.0～11.0 時(shí)，相對(duì)酶活較高，在75%以上，故該堿性蛋白酶在pH 7.0～11.0 內(nèi)仍具有較高的酶活力.在pH 值為9.5 時(shí)，酶活最高，故該堿性蛋白酶的最適反應(yīng)pH 值為9.5，與對(duì)黃海黃桿菌（Flavobacterium yellowsea）YS-80-122 所產(chǎn)海洋低溫堿性蛋白酶的最適pH 值一致[12].Liang 等[13]研究報(bào)道了蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）TKU 022所產(chǎn)堿性蛋白酶的最適pH 值為10.0，李紅等[14]報(bào)道了普魯蘭短梗霉（Aureobasidium pullulans）N2-3所產(chǎn)堿性蛋白酶最適pH 值為9.0，與本試驗(yàn)中堿性蛋白酶的最適pH 值相近.Chellappan S 等[15]研究報(bào)道了白色側(cè)齒霉菌（Engyodontium album）BTMFS 10 產(chǎn)堿性蛋白酶的最適pH 值為11，與本試驗(yàn)研究的堿性蛋白酶最適pH 值相差較大.根據(jù)堿性蛋白酶的定義[16]，本試驗(yàn)蛋白酶有堿性蛋白酶的特征，為堿性蛋白酶.

圖1 pH 對(duì)堿性蛋白酶的影響

2.2 pH 對(duì)堿性蛋白酶活力穩(wěn)定性的影響（圖2）

圖2 pH 對(duì)堿性蛋白酶穩(wěn)定性的影響

從圖2 可以看出，50 ℃水浴保溫30 min 后，蛋白酶在pH 7～11 的范圍內(nèi)的穩(wěn)定性較好，在pH 5、pH 6、pH 12 時(shí)，蛋白酶活力下降迅速.在pH 9時(shí)，蛋白酶的穩(wěn)定性最好.綜上所述，在堿性條件下，該蛋白酶的穩(wěn)定性較好，具有較寬的pH 值區(qū)間；在酸性和極端堿性條件下，蛋白酶pH 值穩(wěn)定性較差.Singh S K 等[17]報(bào)道的蠟狀芽孢桿菌SIU 1來(lái)源堿性蛋白酶和Beg Q K 等[18]報(bào)道的莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）來(lái)源堿性蛋白酶均在pH 7～11 的范圍內(nèi)穩(wěn)定，與本試驗(yàn)研究的高地芽孢桿菌PY41 產(chǎn)堿性蛋白酶的pH 值穩(wěn)定范圍相同.

通過(guò)研究pH 值對(duì)高地芽孢桿菌所產(chǎn)堿性蛋白酶活力的影響，得出該酶在較寬的pH 值范圍內(nèi)（pH 7～11）表現(xiàn)出卓越的蛋白酶活力和穩(wěn)定性，這些酶性質(zhì)有利于該蛋白酶在堿性環(huán)境中和在洗滌劑中的應(yīng)用.

2.3 溫度對(duì)堿性蛋白酶活力的影響（圖3）

圖3 溫度對(duì)堿性蛋白酶的影響

從圖3 可知，在溫度小于50 ℃時(shí)，蛋白酶活力隨溫度的升高而升高；在溫度高于50 ℃時(shí)，蛋白酶活力隨溫度的升高而迅速降低；在50 ℃時(shí)，蛋白酶活力最高，為最適反應(yīng)溫度，與Annamalaia N等[19]和Abidi F 等[20]對(duì)堿性蛋白酶最適反應(yīng)溫度的研究結(jié)果一致.當(dāng)溫度小于40 ℃時(shí)，蛋白酶活力均在70%以下，且隨著溫度的下降，堿性蛋白酶的酶活力亦下降顯著；在60 ℃時(shí)，酶活力則下降至30%左右；在40～55 ℃范圍內(nèi)，蛋白酶的酶活力較高，均在70%以上，故在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)選擇此溫度范圍.

2.4 溫度對(duì)堿性蛋白酶活力穩(wěn)定性的影響（圖4）

圖4 溫度對(duì)堿性蛋白酶穩(wěn)定性的影響

從圖4 可知.在40 ℃時(shí)，蛋白酶活力穩(wěn)定性較好，保持在80%以上；在50 ℃時(shí)，蛋白酶活力下降至60 %左右；60 ℃水浴20 min 后，該堿性蛋白酶活力就下降至40 %左右，當(dāng)水浴60 min 時(shí)，該堿性蛋白酶酶活力則嚴(yán)重下降至10%左右，影響其在實(shí)際中的應(yīng)用.可以得出蛋白酶在小于50 ℃時(shí)穩(wěn)定性較好，在大于60 ℃時(shí)穩(wěn)定性較差.故該蛋白酶同其他堿性蛋白酶一樣，耐熱性不強(qiáng).Bidochka M J 等[21]研究得出白僵菌（Beauveria bassiana）所產(chǎn)堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度范圍為37～42 ℃，在40 ℃水浴保溫30 min 后，酶活力損失近40%，本試驗(yàn)純化的堿性蛋白酶溫度穩(wěn)定性與該蛋白酶酶相比，穩(wěn)定性相對(duì)較好.

結(jié)合溫度對(duì)堿性蛋白酶的影響結(jié)果，在40～55℃蛋白酶酶活力較高，在40～50 ℃不僅酶的穩(wěn)定性較好，同時(shí)還可使酶活力保持在一個(gè)較高的水平.

2.5 金屬離子、EDTA、SDS 對(duì)堿性蛋白酶活力的影響（圖5）

圖5 金屬離子、EDTA、SDS 對(duì)堿性蛋白酶酶活力的影響

有研究發(fā)現(xiàn)微生物堿性蛋白酶的來(lái)源不同，金屬離子對(duì)蛋白酶的影響也不同[22].從圖5 可以看出，Mg2+、Fe2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Na+、SDS 對(duì)蛋白酶的酶活力基本沒(méi)有影響，Ag+、Hg2+、EDTA、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Zn2+對(duì)蛋白酶均具有抑制作用，且Ag+和Hg2+對(duì)蛋白酶的抑制作用非常顯著，蛋白酶酶活降低了約90%，說(shuō)明該蛋白酶活性中心的氨基酸殘基含有巰基[23].Ba2+、Ca2+、Mn2+對(duì)蛋白酶酶活具有激活作用，與金屬離子對(duì)芽孢桿菌（Bacillus sp）B001 產(chǎn)蛋白酶的影響結(jié)果相似[24].其中Mn2+對(duì)蛋白酶酶活具有明顯的激活作用，使蛋白酶活力提高了近18%，表明這些金屬離子能幫助維持蛋白酶催化活性中心的構(gòu)象.該酶對(duì)EDTA 較為敏感，所以此酶可能為金屬離子蛋白酶[25].不同金屬離子對(duì)蛋白酶活力的抑制作用由強(qiáng)到弱依次為Ag+、Hg2+、EDTA、Cu2+、Pb2+、Fe3+、Fe2+、Co2+、SDS、Na+、Mg2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+.

2.6 堿性蛋白酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

Km值是當(dāng)酶反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度，Km值的大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無(wú)關(guān)，Km值越小表明酶與底物的親和力越大.根據(jù)Lineweaver-Burk 法測(cè)得的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)如圖6 所示，計(jì)算出該堿性蛋白酶的Km值為15.5 mg/mL，vmax為24.57 μg/（min·mL）.

圖6 Lineweaver-Burk 法測(cè)酶的Km值和vmax值

研究表明，有些蛋白酶的Km值較小，如Gupta A 等[23]研究的堿性蛋白酶以酪蛋白為底物時(shí)的Km值為2.0 mg/mL；地衣芽孢桿菌JF-U N122 所產(chǎn)堿性蛋白酶，以酪蛋白為底物時(shí)的Km值為5.26 μg/mL[11].而有些堿性蛋白酶的Km值較大，某菌株產(chǎn)堿性蛋白酶以酪蛋白為底物時(shí)的Km值為11 mg/mL[26]；嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophile）所產(chǎn)蛋白酶以酪蛋白為底物時(shí)的Km值為17.6 mg/mL[27].本試驗(yàn)純化的堿性蛋白酶以酪蛋白為底物時(shí)的Km值較大，與酪蛋白的親和力不高，故需在較高的酪蛋白底物濃度下進(jìn)行酶解反應(yīng).

3 結(jié)論

蛋白酶在工業(yè)用酶中占據(jù)較大的比重，其中堿性蛋白酶因其獨(dú)特的水解特性，成為蛋白酶研究中的熱點(diǎn).而尋找具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能，能夠適應(yīng)特別生產(chǎn)要求的新型堿性蛋白酶，具有重要的研究意義.高地芽孢桿菌為2006 年發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌新種，國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究較少，所以對(duì)高地芽孢桿菌的研究具有巨大的潛力.本文對(duì)高地芽孢桿菌所產(chǎn)堿性蛋白酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究，表明該蛋白酶的最適反應(yīng)pH 值為9.5，在較寬的pH 值范圍內(nèi)仍具有較高的酶活力，在pH 7～9 范圍仍具有較好的穩(wěn)定性.該堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，在40～55 ℃蛋白酶酶活力較高，在40～50 ℃不僅酶的穩(wěn)定性較好，同時(shí)還可使酶活力保持在一個(gè)較高的水平.5 mmol/L 的Ag+和Hg2+對(duì)蛋白酶的抑制作用非常顯著，蛋白酶酶活降低了約90%，5 mmol/L 的Mn2+對(duì)蛋白酶酶活具有明顯的激活作用，使蛋白酶酶活力提高了近18%，而SDS 對(duì)該堿性蛋白酶的酶活基本沒(méi)有影響.該堿性蛋白酶的Km值為15.5 mg/mL，vmax為24.57 μg/（min·mL），其Km值較大，與底物的親和力較小，即在較高的底物濃度下，才能達(dá)到較好的酶解效果.

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