四通道熒光成像觀察膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管起源

梅鑫 張清平 陳建良 陳銀生 張潔 陳芙蓉 陳忠平* (中山大學(xué)腫瘤防治中心神經(jīng)外科，廣東 廣州 50060; 深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 深圳 580; 蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 蘇州 5000)

四通道熒光成像觀察膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管起源

梅鑫1張清平2陳建良2陳銀生1張潔3陳芙蓉1陳忠平1*
(1中山大學(xué)腫瘤防治中心神經(jīng)外科，廣東 廣州 510060;2深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 深圳 518033;3蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 蘇州 215000)

目的膠質(zhì)瘤的血管起源于宿主還是腫瘤本身一直存在爭議。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞有向內(nèi)皮細(xì)胞分化的能力。方法本研究我們將膠質(zhì)瘤干細(xì)胞用熒光蛋白標(biāo)記后，移植于熒光鼠皮下成瘤，再采用熒光標(biāo)記腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞(CD34)，通過四通道熒光顯像觀察移植瘤的血管。結(jié)果我們在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞GSC-1建立穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的RFP-GSC-1細(xì)胞系。在綠色熒光裸鼠移植成瘤后，對移植瘤標(biāo)本的四通道熒光成像結(jié)果顯示：移植瘤的大部分血管來源于宿主，但在其中一個移植瘤中發(fā)現(xiàn)有移植腫瘤細(xì)胞來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞，位于腫瘤中央?yún)^(qū)域。結(jié)論本研究結(jié)果提示，移植瘤的血管主要是宿主來源細(xì)胞為主的管道，同時也存在腫瘤細(xì)胞來源的管道。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤; 熒光裸鼠; 免疫熒光

近年研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤血管新生方式不僅僅有傳統(tǒng)觀念認(rèn)為的宿主血管來源的芽生和套疊[1]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在一種新的血管生成模式，即擬態(tài)管道發(fā)生[2]。對于這種不表達(dá)或者低表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的管道上構(gòu)成管壁細(xì)胞的來源研究很少。有學(xué)者認(rèn)為是具有多項分化能力的腫瘤干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化形成[3]，也有學(xué)者認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中滯留在血管壁上的一個短暫的現(xiàn)象[4]。也有認(rèn)為其來源于宿主骨髓造血干細(xì)胞[5]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[6]。為了能夠闡明擬態(tài)管道上的管壁細(xì)胞的來源，我們需要建立一個觀察模型來顯現(xiàn)管道形成的過程。

研究發(fā)現(xiàn)特定條件下進(jìn)行三維培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞(RFP-GSC-1)能逐漸形成管道樣結(jié)構(gòu)，同時細(xì)胞表面的分子標(biāo)記物也在變化，逐漸表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物[7]。體外的膠質(zhì)瘤細(xì)胞是在特定條件下向內(nèi)皮細(xì)胞分化，對于體內(nèi)環(huán)境中的膠質(zhì)瘤細(xì)胞如何在腫瘤形成早期獲得血供我們還不是很清楚。我們將體外研究使用的RFP-GSC-1細(xì)胞進(jìn)一步用于裸鼠移植瘤模型，來探尋體內(nèi)膠質(zhì)瘤微循環(huán)模式的構(gòu)筑。

裸鼠移植瘤模型能很好的模擬腫瘤發(fā)生時的體內(nèi)環(huán)境，準(zhǔn)確反映宿主和腫瘤之間的相互影響下管道形成的模式。由于需要同時觀察腫瘤細(xì)胞、裸鼠自身內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面分子標(biāo)記物，我們建立了四通道熒光成像觀察熒光鼠移植瘤模型，觀察腫瘤血管新生模式，從而分析擬態(tài)管道管壁細(xì)胞的來源。

材料與方法

一、主要試劑和設(shè)備

表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)(Sigma, 美國)、成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(Sigma, 美國)、B27(Invitrogen, 美國)、DMEM/F12(Gbico, 美國)、Triton-X100 (中衫金橋, 中國)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(中衫金橋, 中國)、Alexa fluor@647(Abcam, 美國)、抗淬滅劑(Abcam, 美國)、一抗均來自美國Abcam公司。5只4 w齡Foxn1nu/b6-cag-egfp/su品系鼠，為蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院黃強(qiáng)等[8]建立的出生后全身組織細(xì)胞帶有綠色熒光的無胸腺免疫裸鼠(許可證號碼：SYXK(蘇)2012-0045)由蘇州大學(xué)實驗動物中心提供。按spf(specific pathogen free animals)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter, 美國)、慢病毒(GeneChem, 中國)。

二、建立RFP-GSC-1細(xì)胞系

復(fù)蘇之前本實驗室建立的GSC-1細(xì)胞系[7]并控制其處于對數(shù)生長期，向細(xì)胞懸液中加入5 μl Polybrene以及2 ml的病毒培養(yǎng)上清，混勻，懸浮培養(yǎng)于添加0.04 ng/ml EGF、1 μl/ml bFGF、0.02 ml/ml B27的DMEM/F12干細(xì)胞培養(yǎng)液中。感染6 h后加入2 ml新鮮培養(yǎng)基，待感染細(xì)胞增長至80%以上密度后，進(jìn)行嘌呤霉素壓力篩選。篩選3 d后檢驗陽性細(xì)胞純度。

三、檢驗RFP-GSC-1細(xì)胞純度

GSC-1和新建立的RFP-GSC-1細(xì)胞傳代培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，懸浮培養(yǎng)于添加0.04 ng/ml EGF、1 μl/ml bFGF、0.02 ml/ml B27的DMEM/F12干細(xì)胞培養(yǎng)液中。選取對數(shù)生長期的RFP-GSC-1細(xì)胞和對照組GSC-1細(xì)胞，消化、離心，收集細(xì)胞于離心管中，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline, PBS)漂洗3遍，并轉(zhuǎn)移至流式上樣管中備上機(jī)。細(xì)胞終濃度為1～2×106個/ml。細(xì)胞采用Beckman-Coulter公司CXP anlysis進(jìn)行流式細(xì)胞(Flow Cytometry, FCM)分析。

四、裸鼠皮下荷瘤模型

收集處于對數(shù)期生長的RFP-GSC-1細(xì)胞，調(diào)整為密度1×106/ml的單細(xì)胞懸液懸于不含血清的DMEM培養(yǎng)基中，取200 μl細(xì)胞懸液接種于裸鼠背側(cè)肩胛部皮下。待腫瘤直徑2～3 mm時取瘤，中性福爾馬林固定后石蠟包埋，按5 μm厚度切片。

五、CD34免疫熒光染色

移植瘤標(biāo)本石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，3%的雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶的影響， PBS洗3次×5 min，檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L, pH: 6.0)微波修復(fù)，室溫冷卻后PBS洗3次×5 min，山羊血清封閉20 min，滴加稀釋好的CD34(1 ∶1 000)，4℃濕盒內(nèi)過夜，復(fù)溫30 min后PBS洗3次×5分鐘，Alexa Fluor@647孵育40 min后，PBS洗3次×5 min，現(xiàn)配4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染核3 min，PBS洗3次×5 min，抗淬滅劑封片。

結(jié) 果

一、RFP-GSC-1細(xì)胞系和綠色熒光鼠移植瘤模型的建立

建立的RFP-GSC-1細(xì)胞系(圖1 A, 白色箭頭)在培養(yǎng)過程中穩(wěn)定表達(dá)RFP(紅色熒光蛋白)。RFP-GSC-1細(xì)胞系純度達(dá)到98.8%(圖2B)，而對照組(未轉(zhuǎn)入RFP慢病毒的GSC-1細(xì)胞系)幾乎不表達(dá)紅色熒光(圖2A)。在熒光鼠移植瘤模型中可以觀察到在瘤體內(nèi)部較少見到裸鼠的組織細(xì)胞，大部分以腫瘤細(xì)胞為主(圖1B)。在瘤體周邊可以觀察到較多的裸鼠組織細(xì)胞(圖1C)。

二、四通道熒光成像觀察熒光鼠RFP-GSC-1移植瘤微循環(huán)構(gòu)筑

本次應(yīng)用四通道熒光成像主要有：①405波長通道，為藍(lán)色，顯示DAPI染色的細(xì)胞核形態(tài)(圖3A)；②488波長通道，為綠色，顯示表達(dá)GFP的裸鼠細(xì)胞(圖3B)；③594波長通道，為紅色，顯示表達(dá)RFP的腫瘤細(xì)胞(圖3C)；④645波長通道，為黃色，顯示表達(dá)CD34的細(xì)胞(圖3D)。在觀察的5個標(biāo)本中有1個標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的管道，其余四個標(biāo)本都是以宿主來源管道為主。①通過微循環(huán)構(gòu)筑模型的四通道熒光成像發(fā)現(xiàn)以熒光鼠細(xì)胞來源為主的微循環(huán)管道。其中裸鼠來源的GFP細(xì)胞分布在腫瘤周邊，而RFP細(xì)胞少量的散落在局限的區(qū)域(圖3E)，此外增加CD34標(biāo)記物標(biāo)記有內(nèi)皮功能的細(xì)胞呈現(xiàn)黃色熒光(圖3D)。散在的大量供血管道中GFP細(xì)胞分布廣泛(圖3F, 白色箭頭)，而RFP細(xì)胞則分布較局限(圖3E)。大量GFP細(xì)胞表達(dá)CD34(圖3F, 白色箭頭)，也有部分RFP細(xì)胞表達(dá)CD34(圖3G, 白色箭頭)。②通過微循環(huán)構(gòu)筑模型的四通道熒光成像觀察發(fā)現(xiàn)以腫瘤細(xì)胞來源為主的微循環(huán)管道(圖4)。其中裸鼠來源的細(xì)胞帶有GFP呈現(xiàn)綠色熒光(圖4B)，而腫瘤細(xì)胞帶有RFP呈現(xiàn)紅色熒光(圖4C)。此外增加CD34標(biāo)記物標(biāo)記有內(nèi)皮功能的細(xì)胞呈現(xiàn)黃色熒光(圖4D)。在腫瘤區(qū)域普遍表達(dá)RFP，而中心血供處有散在表達(dá)GFP的裸鼠來源的細(xì)胞(圖4E, 白色箭頭)。GFP細(xì)胞構(gòu)成其中一段微循環(huán)CD34+管道(圖4F, 白色箭頭)而RFP細(xì)胞在其周圍形成了許多環(huán)繞的CD34+管道結(jié)構(gòu)(圖4G, 白色箭頭)。

圖1 RFP-GSC-1裸鼠移植瘤模型觀察

Fig 1 Observation of RFP-GSC-1 cells xenograft mouse model

A: RFP-GSC-1 cells expressed RFP; B: In the central area of tumor tissue, there were mainly RFP-GSC-1 cells (red); C: In the marginal area of tumor tissue, there were mainly mouse somatic cells (green).

Scale bar= 50μm.

圖2 RFP-GSC-1細(xì)胞純度檢驗

Fig 2 Purity of RFP-GSC-1 cells

A: GSC-1 of detection control group hardly expressed RFP; B: The purity of RFP-GSC-1 was 98.8%.

圖3 熒光鼠細(xì)胞來源為主的微循環(huán)管道

Fig 3 Microcirculation channels mainly formed by fluorescent mouse cells

A: DAPI stained for uncles, blue; B: Mouse somatic cells expressed GFP, green; C: Tumor cells expressed RFP, red; D: Endothelial cells expressed CD34, orange; E: In the marginal area of tumor tissue, there were mainly mouse somatic cells (white arrows); F: Mouse derived vessels expressed GFP and CD34 (white arrows); G: Tumor cells derived vessels expressed RFP and CD34 (white arrows); H: In the marginal area of tumor tissue, there were mainly mouse derived vessels after merged.

Scale bar 50 μm.

圖4 腫瘤細(xì)胞來源為主的微循環(huán)管道

Fig 4 Microcirculation channels mainly formed by tumor cells

A: DAPI stained for uncles, blue; B: Mouse somatic cells expressed GFP, green; C: Tumor cells expressed RFP, red; D: Endothelial cells expressed CD34, orange; E: In the central area of tumor tissue, there were mainly tumor cells (white arrows); F: Mouse derived vessels expressed GFP and CD34 (white arrows); G: Tumor cells derived vessels expressed RFP and CD34 (white arrows); H: In the central area of tumor tissue, there were mainly tumor cells derived vessels after merged.

Scale bar 50 μm.

討 論

本次研究建立了RFP-GSC-1細(xì)胞系和熒光鼠移植瘤模型。RFP-GSC-1細(xì)胞系是之前研究得到的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞系GSC-1[7]基礎(chǔ)上加入穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白基因而得到。在活細(xì)胞熒光成像中有獨(dú)到的示蹤作用，彌補(bǔ)其它各種染色示蹤辦法只能針對固定處理后的失活細(xì)胞的不足。同時，RFP-GSC-1細(xì)胞系拓展了傳統(tǒng)活細(xì)胞成像的觀察范圍[9]，不僅從形態(tài)方面進(jìn)行記錄，還可以實時監(jiān)測細(xì)胞表面分子標(biāo)記物的變化。近年新興的體內(nèi)腫瘤細(xì)胞示蹤技術(shù)可以直觀的觀察腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。我們同樣建立了RFP-GSC-1熒光鼠移植瘤模型，為之后體內(nèi)腫瘤生物學(xué)特性動態(tài)觀察奠定基礎(chǔ)。RFP-GSC-1熒光鼠移植瘤模型可以有效區(qū)別移植瘤和裸鼠來源的細(xì)胞，排除腫瘤標(biāo)記物的相對特異性的局限，滿足四通道熒光觀察的條件。

在傳統(tǒng)免疫熒光雙染方法中，CD34+細(xì)胞中部分具有明顯核異型性的細(xì)胞來源不明。因此很難客觀的闡述宿主來源的血管和腫瘤細(xì)胞形成的管道之間關(guān)系。RFP-GSC-1熒光鼠移植瘤模型更加精確的反映膠質(zhì)瘤中微循環(huán)的構(gòu)筑，加之CD34免疫熒光染色，能充分展示腫瘤中管道的位置以及管壁細(xì)胞的來源。我們本研究結(jié)果顯示，在腫瘤的邊緣部分主要是裸鼠來源的血管提供腫瘤營養(yǎng)。而在腫瘤內(nèi)部可以觀察到以腫瘤細(xì)胞為主構(gòu)成的管道。CD34+管道的管壁細(xì)胞有腫瘤來源的細(xì)胞和裸鼠來源的細(xì)胞共同構(gòu)成。

多通道熒光成像技術(shù)[11]可以更細(xì)致的描述細(xì)胞分子水平的狀態(tài)和變化。之前的熒光成像研究通常是雙熒光[12]、甚至三熒光染色[13]。本次研究應(yīng)用了四通道熒光成像技術(shù)來展示腫瘤細(xì)胞的生長及分子表型變化，首次結(jié)合熒光鼠和熒光腫瘤加之免疫熒光染色，有效的區(qū)別腫瘤來源細(xì)胞、裸鼠來源細(xì)胞，探索腫瘤生長過程中分子表型變化，排除裸鼠來源細(xì)胞在觀察中的影響。此外RFP-GSC-1熒光鼠移植瘤模型配合多通道熒光成像技術(shù)為活體熒光成像[14]提供基礎(chǔ)，結(jié)合新型的體內(nèi)熒光探針顯像技術(shù)[15]在未來可以在活體內(nèi)觀察腫瘤分子表型，為腦膠質(zhì)瘤精準(zhǔn)治療提供可行的動物實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

我們本研究在五個移植瘤中發(fā)現(xiàn)一個具有移植瘤細(xì)胞來源的血管形成，提示，移植瘤的血管主要是宿主來源細(xì)胞為主的管道，但同時也存在腫瘤細(xì)胞來源的管道，尤其是在腫瘤中央?yún)^(qū)域。其機(jī)制尚不完全明了，但推測可能是腫瘤中央?yún)^(qū)域由于缺氧等因素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化，形成管道，起到微循環(huán)的補(bǔ)償作用。

致謝：感謝蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院黃強(qiáng)教授等提供Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU小鼠及相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)。

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Identificationoftheglioblastomavascularorigincellthroughfour-channelimmunofluorescentimaging

MEIXin1,ZHANGQingping2,CHENJianliang2,CHENYinsheng1,ZHANGJie3,CHENFurong1,CHENZhongping1

1DepartmentofNeurosurgery,SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou510060;2DepartmentofNeurosurgery,FourthPeople'sHospitalofShenzhen,Shenzheng518000;3DepartmentofNeurosurgery,FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Soochow215000, China

ObjectiveThere was a controversy of whether the blood vascular in glioma initiating from host or tumor cell. Our previous study demonstrates that endothelial differentiation capacity of glioma stem cells (GSC-1 cells). The study aims to probe deeply into the origin of the blood vascular in glioma.MethodsGSC-1 cells were labeled by red fluorescent protein (RFP-GSC-1) and transplanted into green fluorescent mouse. The 5 xenograft samples were stained by CD34 (endothelial marker) immunofluorescence (IF) and were observed under four channels immunofluorescence imaging microscope.ResultsThe RFP-GSC-1 cells were established and expressed RFP stably. The xenograft samples were scanned under four channels immunofluorescence imaging microscope. The result showed that the host-derived vessels were the main blood supply system of xenograft tissue. However, one of five samples contained tumor-derived vessels in the central region of xenograft tissue.ConclusionThis study reveals that the majority of blood supply vessels are the host-derived but tumor cell is also an origin of blood vessels in glioma.

Glioblastoma; Fluorescent mouse; Immunofluorescence

1671-2897(2016)15-221-05

·論著·

R 739.41

A

國家自然科學(xué)基金資助項目(81372685)；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(2015CB755505)；廣東省自然科學(xué)基金資助項目(S2013040012894)；廣東省科技計劃項目資助項目(2013B021800067)；深圳市科技計劃項目資助項目(JCYJ20140416094330210)

梅鑫，博士研究生，E-mail: meixin@sysucc.org.cn

*通訊作者： 陳忠平，教授、主任醫(yī)師，E-mail:chenzp@sysucc.org.cn

2016-01-01；

2016-03-30)