串聯(lián)親和純化技術(shù)在研究細(xì)胞內(nèi)相互作用蛋白質(zhì)中的應(yīng)用

劉 俠(綜述)，韋 薇(審校)

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣西 530021； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，廣西 530021)

隨著基因組計(jì)劃的進(jìn)行，僅了解基因DNA序列及表達(dá)已不能解決基因的表達(dá)時(shí)間、表達(dá)量以及蛋白質(zhì)翻譯后的情況。蛋白質(zhì)行使的功能多樣化，包括信息傳遞、生物化學(xué)反應(yīng)等，所有的這些功能是通過(guò)蛋白質(zhì)之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，大規(guī)模、全細(xì)胞分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，建立細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)復(fù)合體之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，為準(zhǔn)確理解蛋白質(zhì)功能，揭示生命活動(dòng)的機(jī)制提供重要信息。目前用于蛋白質(zhì)組間相互作用的方法主要有酵母雙雜交、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶親和層析、噬菌體展示技術(shù)、免疫共沉淀、串聯(lián)親和純化(tandem affinity purification，TAP)技術(shù)和蛋白芯片等及其基于生物信息學(xué)的分析方法，各種技術(shù)都有其優(yōu)劣，在不同研究中功能互補(bǔ)。以下主要介紹TAP技術(shù)及其在細(xì)胞系內(nèi)使用時(shí)需要注意的問(wèn)題。

1 TAP技術(shù)的特點(diǎn)

1.1TAP技術(shù)原理 TAP技術(shù)最早由德國(guó)Rigaut等[1]發(fā)明，并在鑒定酵母菌蛋白復(fù)合物中獲得成功，隨后擴(kuò)展到其他細(xì)胞系及組織[2]。TAP技術(shù)基本原理包括：重組構(gòu)建帶有兩種親和純化標(biāo)簽的融合靶蛋白，然后轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞或組織，帶標(biāo)簽的靶蛋白表達(dá)并結(jié)合上相關(guān)蛋白質(zhì)后，利用標(biāo)簽與相應(yīng)磁珠作用，兩步純化得到相關(guān)蛋白質(zhì)。

1.2TAP技術(shù)優(yōu)點(diǎn) 該方法的主要優(yōu)點(diǎn)概括有四方面：①可以在細(xì)胞生理狀態(tài)下或者接近生理狀態(tài)表達(dá)融合靶蛋白，研究靶蛋白及其未知的相關(guān)蛋白復(fù)合體，更真實(shí)地反映蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的功能；②經(jīng)過(guò)兩次洗脫，降低了非特異蛋白量，相比較于酵母雙雜交更敏感，更少假陽(yáng)性；③可以反映復(fù)雜的蛋白相關(guān)性，除了鑒定到直接結(jié)合蛋白，亦能檢測(cè)到非直接結(jié)合蛋白，甚至捕捉到除蛋白質(zhì)以外的小分子物質(zhì)。④TAP標(biāo)簽種類(lèi)多樣，能根據(jù)研究需要選擇和設(shè)計(jì)標(biāo)簽，技術(shù)適用廣泛且實(shí)用性強(qiáng)。

1.3TAP技術(shù)的限制 每種技術(shù)在研究方面會(huì)有其局限性，TAP技術(shù)也不例外。除TAP標(biāo)簽本身對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響外，在構(gòu)建融合基因?qū)爰?xì)胞系中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞比酵母的同源重組效率差，而通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和外源性啟動(dòng)子穩(wěn)定轉(zhuǎn)染獲得的融合蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)，往往會(huì)引起細(xì)胞生理活動(dòng)的變異，雖然可以利用這點(diǎn)研究特殊情況下的蛋白相互作用，但過(guò)量表達(dá)蛋白結(jié)合大量的分子伴侶和熱激蛋白而絕緣，出現(xiàn)蛋白非正常折疊，細(xì)胞定位變化和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生大量假陽(yáng)性相互作用，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏離[3]。

2 TAP技術(shù)的應(yīng)用

2.1TAP技術(shù)流程 利用TAP技術(shù)鑒定細(xì)胞內(nèi)相互作用蛋白質(zhì)的技術(shù)，應(yīng)用于真核細(xì)胞系流程大致如下：首先選取感興趣的靶蛋白質(zhì)，從細(xì)胞或組織中通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)獲得該蛋白質(zhì)DNA全長(zhǎng)，然后選擇含有標(biāo)簽序列的親本質(zhì)粒，將靶蛋白的與TAP標(biāo)簽蛋白的DNA進(jìn)行重組。如果沒(méi)有帶標(biāo)簽的親本質(zhì)粒，也可以使用全基因合成將靶蛋白和標(biāo)簽蛋白的DNA融合入表達(dá)載體，使用質(zhì)?；蛘呗《巨D(zhuǎn)染至細(xì)胞系，選定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)帶標(biāo)簽靶蛋白的細(xì)胞株，提取蛋白后純化蛋白復(fù)合體，純化的樣本進(jìn)行質(zhì)譜分析等后續(xù)研究。

2.2TAP技術(shù)的成功應(yīng)用 Ogawa等[4]首次使用FLAG/HA(influenza hemagglutinin epitope)串聯(lián)親和標(biāo)簽，在人海拉細(xì)胞系內(nèi)使用帶標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄因子E2F-6蛋白鑒定到E2F-6與Mga和Max組成的蛋白復(fù)合體，進(jìn)而闡釋該復(fù)合體在生物體內(nèi)的功能。Gloeckner等[5]使用StrepⅡ/FLAG標(biāo)簽在人胚腎細(xì)胞HEK293鑒定到Raf(rapidly accelerated fibrosarcoma)和其相互作用蛋白促分裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK1)和14-3-3蛋白；使用該標(biāo)簽?zāi)芸焖儆行У丶兓繕?biāo)靶蛋白，并由此建立了該純化標(biāo)簽的純化標(biāo)準(zhǔn)流程[6]。TAP標(biāo)簽除了鑒定到相互作用蛋白質(zhì)，更可以鑒定到蛋白質(zhì)以外的小分子物質(zhì)。Nonne等[7]在2010年利用TAP技術(shù)上捕獲到mRNA相關(guān)的miRNA，使TAP標(biāo)簽的應(yīng)用更為廣泛。以下按年份整理了部分TAP標(biāo)簽在哺乳類(lèi),尤其是人類(lèi)細(xì)胞系及其鑒定到的蛋白復(fù)合物(表1)。

表1 串聯(lián)親和純化標(biāo)簽的應(yīng)用

*：為RNA； NA：沒(méi)有數(shù)據(jù)； ProtA：蛋白A免疫球蛋白伽馬結(jié)合位點(diǎn)；CBP：鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)；ProtG：蛋白G免疫球蛋白伽馬結(jié)合位點(diǎn)；SBP：鏈霉親和素結(jié)合位點(diǎn)；His：多組氨酸結(jié)合位點(diǎn)；biotin：生物素；StrepⅡ：兩個(gè)鏈霉素親和位點(diǎn)；MYC：MYC結(jié)合位點(diǎn)；HA:influenza hemagglutinin epitope;S-tag：S肽標(biāo)簽；MEF2-A蛋白:肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2抗原；Ku70,Ku80:DNA依賴(lài)蛋白激酶調(diào)節(jié)亞單位；NPM-ALK:間變性淋巴瘤激酶核磷酸蛋白融合蛋白；WT1:Wilms腫瘤基因；Zcchc8:鋅指8；Raf:加速纖維肉瘤蛋白，rapidly accelerated fibrosarcoma；MEK1:促分裂原活化蛋白激酶；14-3-3:14-3-3蛋白；TRF2:端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2；E2F-6:一種真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子；Smad2:絲氨酸/蘇氨酸激酶受體2；Smad3:絲氨酸/蘇氨酸激酶受體3；TRF1:端粒重復(fù)序列結(jié)合因子1;TIN2:TRF1作用核蛋白2；PP2A:蛋白磷酸酶2；GABA(B):γ-氨基丁酸；pre-40S:預(yù)成熟核糖體亞基40；Btk:酪氨酸蛋白激酶；HDGF:肝癌衍生生長(zhǎng)因子；HATH:肝癌衍生生長(zhǎng)因子同源氨基末端；ADAP:黏附脫顆粒促進(jìn)適配蛋白

3 應(yīng)用TAP技術(shù)中需注意的問(wèn)題

3.1常用的TAP標(biāo)簽及其選擇 隨著TAP技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的標(biāo)簽供不同串聯(lián)組合[3]，常見(jiàn)的TAP標(biāo)簽有鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、蛋白A免疫球蛋白伽馬結(jié)合位點(diǎn)(IgG binding domains of protein A,ProtA)、His、FLAG、StrepⅡ和鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合肽等，在選擇上需要考慮的問(wèn)題包括：純化回收率、純度、對(duì)融合蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)的影響，以及成本。因此，標(biāo)簽的大小、TAP標(biāo)簽之間有無(wú)酶切位點(diǎn)，TAP標(biāo)簽的親和率和洗脫條件等都是需要注意的要點(diǎn)。

在最開(kāi)始的實(shí)驗(yàn)中，由于TAP標(biāo)簽體積對(duì)靶蛋白影響明顯，融合蛋白出現(xiàn)表達(dá)變異，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變使其性狀無(wú)法表達(dá)，蛋白質(zhì)功能的改變。通過(guò)小TAP標(biāo)簽可以改善由于親和標(biāo)簽分子質(zhì)量太大對(duì)靶蛋白的影響，目前最小的TAP標(biāo)簽組合的分子質(zhì)量?jī)H有3×103。此外,把TAP標(biāo)簽加在不同的末端也可能改善對(duì)靶蛋白的影響。Cipak等[21]報(bào)道，在TAP標(biāo)簽和靶蛋白之間加入柔性片段可以有效降低TAP標(biāo)簽帶來(lái)的負(fù)面影響。

TAP標(biāo)簽及對(duì)純化柱的親和指數(shù)越高，結(jié)合到純化柱上的概率越大，但同時(shí)洗脫回收率可能下降，對(duì)于難以培養(yǎng)的細(xì)胞系需要選擇高回收率的TAP標(biāo)簽，如FLAG。對(duì)于那些容易降解的靶蛋白，則應(yīng)選擇洗脫條件溫和的TAP標(biāo)簽，如鏈霉親和素結(jié)合位點(diǎn)(streptavidin-binding peptide,SBP)。需多者兼顧的可以考慮使用StrepⅡ標(biāo)簽。多組氨酸結(jié)合位點(diǎn)(Polyhistidine,His)作為商業(yè)純化蛋白是使用最多的標(biāo)簽之一[22]，因其苛刻的洗脫條件，可以用于檢測(cè)細(xì)胞蛋白經(jīng)交聯(lián)處理后的瞬時(shí)作用或者較弱的相互作用蛋白質(zhì)[23]。

酶切位點(diǎn)作為T(mén)AP標(biāo)簽之間的連接，煙草蝕紋病毒酶切位點(diǎn)(tobacco etch virus，TEV)最為常見(jiàn)，另外還有人鼻病毒酶切位點(diǎn)HRV 3C蛋白酶[20]。TEV蛋白酶高效特異，基本不含其他細(xì)胞蛋白識(shí)別點(diǎn)，使用TEV蛋白酶切掉相關(guān)蛋白質(zhì)的概率極低，可以在第一步純化洗脫條件苛刻情況下使用，不同的標(biāo)簽在第一步可以使用同樣的洗脫方法。標(biāo)簽的改良和純化條件的改善使標(biāo)簽對(duì)靶蛋白影響減少，可不用酶切位點(diǎn)，這樣的優(yōu)點(diǎn)是不擔(dān)心TEV酶的污染，但要求兩步純化的標(biāo)簽在洗脫時(shí)都比較溫和。

3.2重組蛋白標(biāo)簽融合的位置 融合標(biāo)簽加在靶蛋白的N端還是C端，需要根據(jù)靶蛋白的特點(diǎn)，例如蛋白功能區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)、信號(hào)肽、加工剪切位置和蛋白的三維結(jié)構(gòu)等選擇TAP標(biāo)簽加入的位置。多數(shù)實(shí)驗(yàn)初始設(shè)計(jì)兩條融合蛋白，來(lái)應(yīng)對(duì)可能無(wú)法順利表達(dá)的問(wèn)題。如果有融合基因構(gòu)建后的mRNA水平與實(shí)際蛋白表達(dá)量不相符的情況出現(xiàn)，可能導(dǎo)致無(wú)法用TAP標(biāo)簽抗體檢測(cè)并純化，則需更換TAP標(biāo)簽位置。

3.3重組蛋白過(guò)表達(dá)和內(nèi)源性蛋白競(jìng)爭(zhēng)的問(wèn)題 實(shí)現(xiàn)融合靶蛋白內(nèi)源水平的表達(dá)和去除內(nèi)源性蛋白競(jìng)爭(zhēng)一直是TAP技術(shù)運(yùn)用在真核細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物體系的難題。目前最多使用反轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染使蛋白質(zhì)表達(dá)量接近生理表達(dá)量，或者用RNA干擾獲得穩(wěn)定表達(dá)生理量水平的帶標(biāo)簽蛋白質(zhì)。另有研究利用基于蛻皮素及其受體的可控誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，根據(jù)需要調(diào)整蛻皮素類(lèi)似物的添加量調(diào)整融合蛋白的表達(dá)水平[24]。對(duì)于內(nèi)源性蛋白競(jìng)爭(zhēng)，F(xiàn)orler等[25]使用RNA干擾和TAP結(jié)合建立的干擾TAP，選擇果蠅相應(yīng)蛋白同源的人類(lèi)蛋白做誘餌，用雙鏈RNA沉默果蠅的內(nèi)源基因，然后再穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)外源基因。還有利用轉(zhuǎn)基因或使用TAP重組基因小鼠[26]，但因?yàn)槌杀靖?、時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量化。

4 展 望

TAP技術(shù)屬于蛋白質(zhì)組學(xué)中“Bottom-up”策略之一，對(duì)研究蛋白質(zhì)功能有很強(qiáng)的實(shí)用性。TAP技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜對(duì)純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，通過(guò)生物信息學(xué)獲得的蛋白相關(guān)性可信度高，為后續(xù)的驗(yàn)證工作節(jié)省大量時(shí)間。TAP和酵母雙雜交得到的蛋白相互作用圖譜中重合性不高，各技術(shù)策略側(cè)重點(diǎn)不同，TAP技術(shù)傾向于蛋白在細(xì)胞自然生理?xiàng)l件下的功能和相互作用，除了檢測(cè)直接相互作用蛋白，更可捕獲間接相互作用蛋白，從而發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的蛋白復(fù)合體。TAP技術(shù)同其他方法獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)充印證，不斷完善蛋白質(zhì)相互作用圖譜。TAP技術(shù)作為研究相互作用蛋白有不可替代的作用，該技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)將是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)蛋白功能，揭示復(fù)雜蛋白作用網(wǎng)絡(luò)的重要手段。

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