神農(nóng)香菊花、莖和葉香氣成分的組成分析

菅 琳,孫 明,張啟翔

(北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083)

神農(nóng)香菊(Chrysanthemumindicumvar.aromaticum)屬菊科菊屬，多分布在湖北神農(nóng)架地區(qū)海拔1 970～2 830 m的山坡、草甸，生長(zhǎng)環(huán)境溫度低、濕度大、陽(yáng)光充足且排水良好。神農(nóng)香菊為多年生草本植物，植株矮小，葉小而厚，深綠色，葉脈隆起；花小，黃色，花期8月中旬至9月上旬。神農(nóng)香菊是野菊的變種，與野菊的主要區(qū)別是其全株具有濃郁的特殊芳香，極具觀賞及藥用價(jià)值。

神農(nóng)香菊最早由中國(guó)科學(xué)院武漢植物研究所劉啟宏等[1]發(fā)現(xiàn)并鑒定，其全株主要化學(xué)成分為α-側(cè)柏酮、β-側(cè)柏酮、龍腦等萜類(lèi)化合物。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)神農(nóng)香菊的研究主要集中在精油提取及藥用成分方面。王國(guó)亮等[2]研究發(fā)現(xiàn)，神農(nóng)香菊干花的精油化學(xué)成分主要有脂肪族類(lèi)、單萜、倍半萜及其氧化物，其中主要成分有丁酸酯類(lèi)、側(cè)柏酮、乙酸龍腦酯等。Wang等[3]對(duì)干燥的神農(nóng)香菊花、莖、葉中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了GC-MS測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，干花中的主要揮發(fā)性成分是乙酸龍腦酯(15.40%)和α-水芹烯(14.18%)等，干葉中的主成分為對(duì)傘花烴 (20.42%)、乙酸龍腦酯(20.41%)和α-水芹烯(13.67%)等，莖段中主要含有反式-β-金合歡烯 (17.95%)、大根香葉烯(12.89%)和 β-水芹烯 (12.70%)等。龔復(fù)俊等[4]利用NMR等波譜手段，在神農(nóng)香菊干花精油中提取并鑒定了木犀草素、木犀黃酮甙等藥用成分。劉朝霞等[5]發(fā)現(xiàn)，神農(nóng)香菊的精油有較強(qiáng)的抗菌活性和氧化能力。

神農(nóng)香菊濃郁的自然花香在菊科植物中十分少見(jiàn)，具有較大的園林應(yīng)用潛力，目前，對(duì)神農(nóng)香菊全株自然香氣成分的測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究利用靜態(tài)頂空吸附結(jié)合DTD-GC/MS方法對(duì)神農(nóng)香菊花、葉、莖的香氣進(jìn)行了比對(duì)分析，以期為進(jìn)一步推廣和應(yīng)用神農(nóng)香菊香氣性狀提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試神農(nóng)香菊為北京林業(yè)大學(xué)胖龍溫室內(nèi)的1年生扦插苗，母株于2012-10采自湖北神農(nóng)架山區(qū)瞭望塔處(海拔2 600～3 000 m)，供試植株均長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲(chóng)害。2013-04將處于花期的神農(nóng)香菊扦插苗置于溫度25 ℃、濕度65%的人工氣候箱中預(yù)培養(yǎng)1周。

1.2 方 法

1.2.1 揮發(fā)物的采集 取活體神農(nóng)香菊盛花期中上部花8～10朵，植株中上部葉片6～7片和植株地上部1 cm去葉莖段各3 g，備測(cè)。

采取頂空吸附技術(shù)將花、莖、葉的揮發(fā)性氣體收集到吸附管中[6-7]，采樣時(shí)間為上午09:30-10:30。具體步驟如下：(1)將含有200 mg Tenax (60/80 mesh) 的吸附管(CAMSCO，Houston，TX，USA)在100 mL/min氮?dú)獾拇祾呦掠?70 ℃活化120 min，吹走其中的內(nèi)含物。(2)將剛剛離體的新鮮花、莖、葉樣品置于采樣袋中(Reynolds，406 mm×444 mm，Richmond，VA，USA)，將采樣袋用橡膠管夾密封。(3)抽干采樣袋內(nèi)的雜質(zhì)空氣(防止雜質(zhì)氣體干擾)，使袋內(nèi)瞬時(shí)達(dá)到近真空狀態(tài)，再以1 L/min的速度打入1 L經(jīng)活性炭過(guò)濾的空氣，待袋中空氣約為袋容積的3/4 時(shí)，保持袋內(nèi)氣體容量。(4)保持采樣袋密閉狀態(tài)，將其置于25 ℃的日光培養(yǎng)箱中靜置40 min。(5)用抽氣泵(GSP-300FT-2，Gastec Corporation，Japan)以200 mL/min的速度將含有揮發(fā)物的氣體抽出，抽樣5 min，并將揮發(fā)物吸附在吸附管里。(6)用上述方法對(duì)花、莖、葉各平行采樣3次，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照，僅對(duì)空氣進(jìn)行采樣分析。(7)采樣結(jié)束后，將吸附管置于干燥的低溫(-20 ℃)環(huán)境中保存待測(cè)。

1.2.2 揮發(fā)物成分的分析 揮發(fā)物成分采用直接熱脫附法-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(Direct thermo desorption/gas chromatography/mass spectrum，DTD-GC/MS)分析。直接熱脫附是熱脫附法的一種，具有所需樣品少、一步完成分離解析的優(yōu)點(diǎn)[8]。吸附管中的樣品在自動(dòng)熱解析器(ATD，automatic thermal desorber，Perkin Elmer Turbo Matrix 650)中加熱解析，通過(guò)惰性載氣將其中的揮發(fā)性物質(zhì)帶入氣相色譜儀中進(jìn)行分析。儀器參數(shù)設(shè)置如下：ATD工作條件：熱脫附溫度為250 ℃(10 min)，載氣氦氣的流速為1.5 mL/min；熱解析溫度260 ℃(10 min)，冷肼迅速加熱到300 ℃(40 ℃/s)，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。GC工作條件：色譜柱為30 m×0.25 mm×0.25 mm的DB-5MS柱；程序升溫：起始溫度為40℃，保持2 min，然后以6 ℃/min的速度升到180 ℃，再以15 ℃/min的速度升到270 ℃，保持3 min。MS工作條件：電離方式為電子電離源(EI)；電子能量為70 eV；掃描范圍為30～500 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

揮發(fā)物的鑒定使用Turbo Mass5.4.2 GC/MS軟件進(jìn)行分析。分析得到的總離子流圖中的不同質(zhì)譜峰經(jīng)NIST08數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后，再將待測(cè)成分的保留指數(shù)與Pherobase數(shù)據(jù)庫(kù)[9]中的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比對(duì)分析，以確定其類(lèi)別。最后應(yīng)用峰面積歸一法計(jì)算出每種組分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 神農(nóng)香菊花的香氣成分分析

從神農(nóng)香菊花的香氣中共分離出79個(gè)峰，通過(guò)NIST08及Pherobase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定出72種化合物，包含了98.03%的花香總揮發(fā)物成分(表1)。從化合物種類(lèi)來(lái)看，花香氣主要由萜烯類(lèi)化合物組成，共有48種，占總揮發(fā)性成分的89.54%，其中，β-側(cè)柏酮的含量最高，占總揮發(fā)性成分的65.48%；脂肪酸衍生物共有18種，占總揮發(fā)性成分的6.72%；另有少量苯類(lèi)及苯丙素類(lèi)化合物。

表1 神農(nóng)香菊花、莖、葉中的揮發(fā)性成分及其相對(duì)含量

續(xù)表 1 Continued table 1

2.2 神農(nóng)香菊葉、莖香氣成分分析

葉、莖香氣成分分析方法與花香一致。與花香成分相比，葉與莖香氣成分種類(lèi)相對(duì)較少，分別鑒定出65和66種化合物，與花香中相同的揮發(fā)性物質(zhì)有55種。葉香氣中的萜烯類(lèi)含量及種類(lèi)與花香相近，相似度>84%，而脂肪酸衍生物種類(lèi)，尤其是酯類(lèi)化合物減少，但葉醇含量大大增加。莖香氣中萜烯類(lèi)相對(duì)含量較高，占總揮發(fā)物成分的94.05%；脂肪酸衍生物等其他物質(zhì)僅占3.68%。葉香氣中萜烯類(lèi)相對(duì)含量為90.21%，香氣中含量最高的成分是α-側(cè)柏酮(55.18%)，其他重要成分(>1%)樟腦、β-石竹烯、大根香葉烯、2-甲基丁酸乙酯在花香成分中也占有較大比例。莖中α-側(cè)柏酮和β-側(cè)柏酮含量較高，分別為33.10%和37.02%，其他如樟腦、β-石竹烯、古巴烯、乙酸桃金娘烯酯、γ-杜松烯含量均超過(guò)1%。

2.3 神農(nóng)香菊花、葉、莖的香氣釋放量

由于花、莖、葉的樣品質(zhì)量相同，在保證采集及分析方法一致的條件下，三者香氣釋放量的計(jì)算可通過(guò)GC/MS總離子流圖實(shí)現(xiàn)。將花、莖、葉分離得到的所有質(zhì)譜峰面積相加比對(duì)各器官香氣釋放豐度，結(jié)果(圖1)表明，花朵中香氣釋放豐度最高(2.67E+10)，莖次之(1.45E+10)，葉片的香氣釋放量最低(0.766E+10)，這與感官評(píng)價(jià)結(jié)果相符。

圖1 神農(nóng)香菊花、莖、葉香氣釋放量的比較

3 討 論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神農(nóng)香菊花、莖、葉自然香氣的主要成分為萜烯類(lèi)物質(zhì)。其中α-側(cè)柏酮與β-側(cè)柏酮含量最高，與神農(nóng)香菊全株及干花精油主成分的測(cè)定結(jié)果[1-2]相符，而在其他重要成分上的差別可能與干燥及測(cè)定方法有關(guān)。側(cè)柏酮屬單萜類(lèi)物質(zhì)，帶有類(lèi)似薄荷的清爽氣味，是一種重要的香料成分。研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)柏酮是河南野菊花精油、菊蒿花香及鼠尾草精油中的主要成分[10-12]。神農(nóng)香菊花、莖、葉香氣中含量大于1%的化合物如樟腦、β-石竹烯、大根香葉烯、桉樹(shù)腦等，也是野菊精油[13-15]、地被菊花香[16-17]及蒿屬植物冷蒿、茼蒿[18-19]的重要成分。

依各器官釋放的香氣物質(zhì)來(lái)看，花香中香氣物質(zhì)最為多樣，且酯類(lèi)、苯類(lèi)物質(zhì)相對(duì)豐富，如2-甲基丁酸甲酯、異丁酸乙酯、苯甲醛、乙酸芐酯、乙酸蘇合香酯等成分僅在花香中檢測(cè)到，這可能與花香呈現(xiàn)出濃郁的清香、甜香、果香味道有關(guān)。葉香氣中α-側(cè)柏酮占有較大比例，葉醇也較多，具有強(qiáng)烈的新鮮草葉的清香及新茶葉和薄荷香。莖中所含脂肪酸衍生物較少，多有木香、薄荷味。神農(nóng)香菊花朵的香氣釋放量最高，莖、葉次之。由于植物香氣物質(zhì)的產(chǎn)生與釋放受到生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控[20]，這一結(jié)果可能與芳香植物處于花期的授粉作用有重要關(guān)系。同時(shí)，目前對(duì)花香化合物合成相關(guān)酶的研究發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)物幾乎都在花瓣和其他花器官的表皮細(xì)胞中合成，從而能更好地?fù)]發(fā)到空氣中[21]， 這也與人們的嗅覺(jué)感觀相符[22]， 因此初步推測(cè)花朵是神農(nóng)香菊的主要釋香器官。而其他營(yíng)養(yǎng)器官只在受到傷害(如機(jī)械損傷、病蟲(chóng)侵染)時(shí)才釋放少量的香氣物質(zhì)[23]，如薄荷在葉片的腺體中積累了大量的花香物質(zhì)，但葉片的釋放量卻很低[24]。

總體來(lái)說(shuō)，神農(nóng)香菊花、莖、葉香氣組成相似，萜烯類(lèi)化合物均是其最主要的揮發(fā)物?；?、莖、葉中主要揮發(fā)性化合物含量的差異可能與不同組織器官的特異性、香氣合成底物及香氣化合物合成酶基因的時(shí)空特異性表達(dá)有關(guān)。在后期的研究中，本課題組將借助分子手段克隆神農(nóng)香菊香氣化合物合成基因及相關(guān)酶基因，分析其功能和表達(dá)模式，探索重要花香基因的生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制，以為菊花花香育種提供理論基礎(chǔ)。

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