應(yīng)用HPLC色譜技術(shù)進行柃屬植物化學(xué)分類學(xué)研究*

石祥剛，李成仁，李凱凱，葉創(chuàng)興

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510275)

柃屬(EuryaThunb.)隸屬于山茶科(Theaceae)，目前共約130余種，為山茶科第二大屬，主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)、夏威夷群島及西南太平洋各島嶼。我國有84種14變種，分布于長江流域以南各省區(qū)，是我國熱帶、亞熱帶常綠闊葉林下常見林木[1-2]。柃屬植物因其具單性花而明顯不同與山茶科其他各屬，在本科系統(tǒng)演化上具有重要地位。國內(nèi)對于柃屬的研究，前期僅限于新分類群的整理和報道[3-4]。1966年，林來官對國產(chǎn)柃屬植物作了全面的修訂，強調(diào)雄花花藥是否具分格的性狀特征，并據(jù)此把我國柃屬植物分為格藥柃組和真柃組2 組[5]。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，本屬植物花通常細小,結(jié)構(gòu)差異不顯著,種間鑒別非常困難，加上普遍花期較短,并且雄花很快脫落,完全依賴花的結(jié)構(gòu)來鑒定物種常常受到制約。再者，近年來雄花花藥無格的類群中發(fā)現(xiàn)了親緣關(guān)系極近的花藥具格的種類[6]，這一結(jié)果也提示柃屬內(nèi)部分物種的分類地位是不明確的。因此，尋找多學(xué)科實驗手段對柃屬植物進行系統(tǒng)分類學(xué)研究已成為本屬植物進一步研究的必然要求。植物化學(xué)分類是植物分類學(xué)與植物化學(xué)相互補充的一門實驗分類學(xué)科，在解決一些科屬分類學(xué)疑難問題上發(fā)揮著重要作用[7-8]。近10年來，由于研究方法及設(shè)備的完善，化學(xué)分類研究也轉(zhuǎn)向于全面分析植物所含的有效成分，高效液相色譜法是用得最為廣泛的一種方法，HPLC圖譜能夠直觀顯示生物體中的化學(xué)信息，結(jié)合相關(guān)聚類分析軟件，已在物種的鑒別上獲得成功，在探討近緣類群的系統(tǒng)關(guān)系方面發(fā)揮著越來越多的作用[9-10]。

鑒于柃屬植物的化學(xué)分類研究尚屬空白，本研究嘗試采用HPLC色譜法對柃屬植物的主要化學(xué)成分進行標記分析，并進一步探討其分類學(xué)意義，以期為柃屬植物種類的鑒別和系統(tǒng)學(xué)研究提供新的證據(jù)和線索。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究共涉及柃屬植物24種1變種共計28個樣品，涵蓋了國產(chǎn)柃屬植物2組8系的主要形態(tài)類群，所有實驗材料均采自于同一季節(jié)(10-11月份)，具體材料來源見表1，憑證標本均存放于中山大學(xué)植物標本室(SYS)。

表1 植物化學(xué)分類實驗材料及其來源Table 1 sources of plant materials used for chemotaxonomy

1.2 方法

供試樣品溶液的制備：取適量植物葉片于60 ℃烘干，磨成粗粉。稱取干燥、粉碎樣品0.3 g置于50 mL錐形瓶中，加入沸水50 mL；90 ℃下恒溫水浴30 min，每5 min振搖一次使提取均勻；水浴后取出放冷至室溫，用微孔膜過濾后定容至100 mL作為供試樣品。

色譜條件：色譜柱：Supelco Discovery RP Amide C16柱(25 cm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：w=0.05%磷酸水溶液；流動相B：乙腈；梯度條件：0～40 min，流動相B 10%～30%；40～48 min，流動相B 30%；柱溫：35 ℃，檢測波長:210 nm。

參照物的選擇：因為缺乏相應(yīng)的標準品，我們選擇供試材料中的一個典型物種堅桃葉柃E.persicaefolia的色譜峰作為對照(圖1)，其色譜峰中保留時間為16.7, 19.2, 20.6, 42.9, 46.8 min的5個色譜峰峰形穩(wěn)定，與其他峰分離良好，在所有樣品中有規(guī)律的出現(xiàn)，并且保留時間適中，故采用這5個峰作為參照物峰，以考察不同材料的保留時間。

圖1 柃屬植物參照物HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance in the genus Eurya

樣品測定：精密吸取供試樣品及參照物樣品溶液各20 μL注入高效液相色譜儀中，按照確定的色譜條件進行實驗。

方法學(xué)考察：取本屬代表物種堅桃葉柃E.persicaefolia樣品提取溶液，按上述提取方法、色譜條件和測定方法，進行精密度試驗。HPLC色譜圖結(jié)果表明，共有峰指紋峰保留時間和相對峰面積RSD值均小于3.0%，表明該圖譜方法精密度符合要求。此外，不同實驗日期及不同批次提取溶液的各共有峰相對保留時間和相對峰面積比值無明顯變化(RSD值分別為1.25%～1.58%和1.92%～2.33%), 說明本方法穩(wěn)定且具有重現(xiàn)性，可進行指紋圖譜分析。

2 研究結(jié)果

2.1 HPLC圖譜的直觀結(jié)果及化學(xué)性狀的選取

在本實驗的色譜條件下，檢測樣品中的全部化學(xué)成分可以在50 min內(nèi)檢測完畢，28個樣品的HPLC色譜圖如圖2所示，所有樣品色譜圖整體面貌相似，各主要成分分離良好。根據(jù)參照樣品堅桃葉柃色譜峰的出峰時間，將各樣品檢測到的色譜峰進行初步確認，把所有樣品各色譜峰的保留時間從小到大排列起來，每個保留時間對應(yīng)的峰標記為一種化學(xué)成分，記錄其具體保留時間和峰面積，獲得柃屬植物化學(xué)成分的原始數(shù)據(jù)，為避免過多干擾，本研究沒有將一些保留時間不確定的色譜峰統(tǒng)計在內(nèi)，最終確定出23個化學(xué)成分,其編號及相對保留時間如下：1：4.7 min；2：5.0 min；3：9.2 min；4：9.7 min；5：10.3 min；6：16.9 min；7：18.5 min；8：19.4 min；9：20.8 min；10：21.6 min；11：27.3 min；12：27.7 min；13：29.9 min；14：30.4 min；15：30.9 min；16：31.6 min；17：32.6 min；18：34.2 min；19：36.6 min；20：41.3 min；21：42.3 min；22：42.8 min； 23：46.8 min。其中6、8、9、22、23號峰為柃屬植物典型峰，在大部分樣品中均有規(guī)律的出現(xiàn)，并且峰形穩(wěn)定，峰面積相對較大，為柃屬植物主要化學(xué)成分。

2.2 化學(xué)成分的聚類結(jié)果

在waters 色譜工作站下進一步對色譜峰比較分析發(fā)現(xiàn)，同一物種不同產(chǎn)地或不同生態(tài)型的材料在化學(xué)成分的含量上有高低不同變化，但化學(xué)成分的有無特性則保持相對穩(wěn)定(見圖2中所示窄基紅褐柃、米碎花與細齒葉柃3個物種的不同樣品)。因此為進一步探討柃屬植物化學(xué)成分的分類學(xué)意義，本研究將所選定的化學(xué)成分進行標準化處理(Range 0 to1)，具體編碼數(shù)據(jù)矩陣見表2。

圖2 柃屬28個樣品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of 28 samples in the genus Eurya

類群化學(xué)成分編碼格藥柃組Sect.Meristocheca華南毛柃E.ciliata00110010000000000000000長毛柃E.patentipila00001010011000000100010二列葉柃E.distichophylla00000000000000001001100毛果柃E.trichocarpa01110101100101001000111尖萼毛柃E.acutisepala00110001100101001111110尖葉毛柃E.acuminatissima11000100100100100001011披針葉毛柃E.henryi00001001101000001001110微心葉毛柃E.subcordata00001010011010000100110肖櫻葉柃E.pseudocerasifera11110101101000001010011大花柃E.magniflora11110101100101011110011堅桃葉柃E.persicaefolia10110101100101010111111景東柃E.jintungensis10001011111010000100010四角柃E.tetragonoclada10000000000001000100010凹脈柃E.impressinervis10000000000000000010010真柃組Sect.Eurya崗柃E.groffii00110111100100011011111偏心葉柃E.inaequalis00110110000000101011011米碎花E.chinensis-110001100000000000010011米碎花E.chinensis-211001100000000000001111細齒葉柃E.nitida-100000000000010110000010細齒葉柃E.nitida-210000000000010110000010卵葉柃E.ovatifolia00110001101000000001110紅褐柃E.rubiginosa00110001101010010001110窄基紅褐柃E.rubiginosavar.attenuata-100110001100110010001110窄基紅褐柃E.rubiginosavar.attenuata-200111001100110010001110隆林耳葉柃E.lunglingensis00010011100010010100000腺柃E.glandulosa00111011100010000000010短柱柃E.brevistyla00001010011001000100110微毛柃E.hebeclados10001010010001000110010

圖3 柃屬基于化學(xué)成分的UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA dendrogram of Eurya based on chemical constituents

圖4 柃屬基于化學(xué)成分的NJ聚類圖Fig.4 NJ dendrogram of Eurya based on chemical constituents

將表2將所得矩陣分別采用UPGMA法和NJ法進行聚類分析,所得聚類樹形圖如圖3和圖4所示。

UPGMA聚類樹形圖顯示根據(jù)化學(xué)成分可將研究的柃屬植物分為4個分支:第I分支包括華南毛柃、腺柃、隆林耳葉柃、卵葉柃、紅褐柃、窄基紅褐柃、二列葉柃、披針葉毛柃8個種類；第II分支包括長毛柃、微心葉毛柃、短柱柃、景東柃、四角柃、凹脈柃、微毛柃、細齒葉柃8個種類；第III分支包括毛果柃、大花柃、堅桃葉柃、尖萼毛柃、崗柃和肖櫻葉柃6個種類；第IV分支包括尖葉毛柃、米碎花、偏心葉柃4個種類。

NJ聚類圖與UPGMA聚類圖相似，近緣種的分支兩個聚類圖基本相同，如微心葉毛柃、短柱柃、景東柃，華南毛柃、隆林耳葉柃、腺柃，卵葉柃、紅褐柃、窄基紅褐柃，偏心葉柃、崗柃、肖櫻葉柃、大花柃、堅桃葉柃這些分支。

綜合兩種聚類圖結(jié)果，化學(xué)成分分析所得種間關(guān)系和柃屬現(xiàn)有的分類安排有一定關(guān)聯(lián)，特別是在近緣類群方面表現(xiàn)突出,能較好解釋部分種的親緣關(guān)系，但并不能很好地解決柃屬屬內(nèi)系統(tǒng)演化路線。

3 討 論

3.1 HPLC圖譜在柃屬分類學(xué)研究中的可行性

作為山茶科的第二大屬，長期以來，柃屬植物的分類學(xué)研究主要以形態(tài)性狀為主，缺乏從實驗數(shù)據(jù)中獲取分類依據(jù)的相關(guān)研究。鑒于植物物種的變異式樣和進化關(guān)系呈現(xiàn)出錯綜復(fù)雜的現(xiàn)象，就不能單憑某些證據(jù)完全了解和掌握，綜合利用各方面的信息才有可能得到符合客觀實際的結(jié)論。植物的化學(xué)成分是植物生理化學(xué)特性演化路線的內(nèi)在表現(xiàn)，每一個種與其在遺傳上有聯(lián)系的種共同分享它們的生理化學(xué)特征，這正是化學(xué)分類研究的理論基礎(chǔ)[11]。作為目前化學(xué)分類研究中用得最為廣泛的一種測定方法，HPLC色譜圖能夠直觀顯示生物體中的化學(xué)信息，與基于分子標記的DNA指紋圖譜研究類似，HPLC圖譜其本質(zhì)正是對化學(xué)成分的一種顯性標記，能夠?qū)ξ锓N進行輔助鑒別，選擇合適的聚類分析軟件，可用于探討種間親緣關(guān)系[12-14]。

目前HPLC圖譜方法尚未引入到柃屬植物研究領(lǐng)域，我們參考了本實驗室在對同科植物茶的研究中建立的HPLC圖譜相關(guān)技術(shù)[15]，并在其基礎(chǔ)上對色譜條件進行多次調(diào)整和優(yōu)化，最終建立了適合于柃屬植物的HPLC標記方法，結(jié)果表明，在此條件下柃屬植物葉水提取物中的化學(xué)信息豐富，各主要色譜峰保留時間適中，分離度較好，基線平穩(wěn)，能明確標記柃屬植物葉中的主要化學(xué)成分。

由于缺乏相應(yīng)的標準品，HPLC圖譜中的各色譜峰對應(yīng)的化合物沒有得到確認，但這并不妨礙根據(jù)保留時間進行化學(xué)成分的顯性標記，本研究是基于化學(xué)性狀顯性標記的原理并結(jié)合聚類軟件進行化學(xué)分類分析的一種嘗試和探索。對于聚類分析的數(shù)據(jù)處理，我們還嘗試利用原始數(shù)據(jù)直接進行分類，但效果并不理想，因為同一物種因產(chǎn)地的不同，其化學(xué)成分的含量常有大幅的變化，為消除變量變化幅度的影響，研究中將原始數(shù)據(jù)進行標準化處理。從研究結(jié)果來看，該方法在柃屬內(nèi)是切實可行的，并且具有操作簡單快捷、重現(xiàn)好的特點，可為本屬物種分類研究提供重要參考。

3.2 HPLC圖譜在柃屬植物中的分類學(xué)意義

柃屬是山茶科中較為特殊的一個類群，種間差異不顯著，已有的分子數(shù)據(jù)表明，柃屬的葉綠體基因在種間幾無變異，核基因ITS序列種間距離為0～16[16]，在探討系統(tǒng)發(fā)育中存在不足，因此，挖掘其他實驗數(shù)據(jù)的分類學(xué)意義是十分必要的。本研究結(jié)果表明，HPLC圖譜具有直觀性和可重現(xiàn)性，化學(xué)成分對應(yīng)的色譜峰在種內(nèi)穩(wěn)定出現(xiàn)，在種間呈現(xiàn)多樣性，特別是1、2、6、8、9、22、23這7個色譜峰在柃屬內(nèi)有規(guī)律的出現(xiàn)，應(yīng)為本屬主要化學(xué)成分，適合用于物種的輔助鑒別。一些在形態(tài)學(xué)上較難區(qū)分的種類，在HPLC圖譜上也有著明顯的區(qū)別。如毛果柃、尖萼毛柃和尖葉毛柃這三個種，從形態(tài)特征上來看，這3個種非常相似，區(qū)別僅在于花的一些細微結(jié)構(gòu)上，毛果柃和尖萼毛柃雄花花藥具格，而尖葉毛柃花藥無格，若無雄花，很難準確鑒定這3個物種。而從HPLC圖譜來看，毛果柃與尖萼毛柃的色譜峰更為接近，都具有9、12、16這幾個峰，相反，尖葉毛柃則無，此外，毛果柃與尖葉毛柃均具有23號峰，而尖萼毛柃則無此峰，因此，結(jié)合這幾個特征峰，即使只有葉片，也可以很容易且直觀地將這3個種區(qū)別開來。同樣的例子也存在于其他近緣種，如卵葉柃與窄基紅褐柃等。本研究表明，借助于HPLC法建立的指紋圖譜可作為鑒定物種的一種簡便而行之有效的輔助方法，在應(yīng)用上有著其他手段不可替代的作用。

兩種聚類樹形圖的結(jié)果表明化學(xué)成分在分析柃屬近緣種類方面具有一定優(yōu)勢，如卵葉柃、紅褐柃和窄基紅褐柃、二列葉柃和披針葉毛柃，長毛柃與微心葉毛柃、四角柃與凹脈柃，毛果柃和尖萼毛柃、大花柃與堅桃葉柃等親緣關(guān)系極近的物種在化學(xué)分類方面均得到了較好的聚類，特別是毛果柃與尖萼毛柃聚在了同一分支，尖葉毛柃則聚在了另一分支，與形態(tài)學(xué)證據(jù)相吻合。當然，化學(xué)分類在柃屬種類的親緣關(guān)系的比較上亦具有一定的局限性，一些親緣關(guān)系較近的種類并沒有得到很好的聚類，如細齒葉柃及米碎花是兩個親緣關(guān)系較近的種類，在化學(xué)性狀聚類圖上分別聚到了不同分支上。整體上看來，化學(xué)分類的結(jié)果與形態(tài)學(xué)結(jié)果相比，既有相似之處又存在一定的矛盾，這也恰恰表明植物的系統(tǒng)演化是一個復(fù)雜的過程，不同性狀之間的演化存在不同步性?？傊?，柃屬植物化學(xué)分類結(jié)果能在一定程度上彌補形態(tài)學(xué)的不足，在本屬系統(tǒng)分類研究上具有重要意義。

為了進一步探討柃屬植物內(nèi)化學(xué)成份的穩(wěn)定性，本研究還同時對不同產(chǎn)地且形態(tài)變異較大種類作了對照研究，如米碎花、細齒葉柃、窄基紅褐柃等種，這些種不同分布地的類群在外部形態(tài)上有著較大的生態(tài)變異，如米碎花存在大葉型(E.chinensis-1)與小葉型(E.chinensis-2)兩種生態(tài)變異，細齒葉柃存在厚葉粗齒型(E.nitida- 1)與薄葉細齒型(E.nitida-2)兩種變異，窄基紅褐柃在葉基上均有著不同變異。所得結(jié)果表明，柃屬植物內(nèi)化學(xué)成分種類的有無在種內(nèi)表現(xiàn)為較高的穩(wěn)定性，各物種均得到了較好的聚類結(jié)果。

值得注意的是，柃屬植物還是一種稀有藥用植物，體外抗腫瘤活性研究發(fā)現(xiàn)，從本屬植物葉中提取的苯丙素苷類化合物對人原髓細胞白血病癌細胞(HL-60)及小鼠巨噬細胞瘤細胞(RAW264.7)具有明顯抑制作用，近年來相關(guān)研究多有報道[17-18]。柃屬植物在我國具有豐富的野生資源，在我國分布的84 種柃屬植物中，約有63 種為我國特有分布，占總數(shù)的75%，蘊藏著極為豐富的野生可利用資源，因此，本研究有關(guān)柃屬HPLC圖譜研究不僅可以用于柃屬物種鑒別、種間親緣關(guān)系和分類的探討，還可以為本屬種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供重要的參考。

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