獨(dú)角蓮中酪氨酸酶活性抑制成分的提取工藝研究

宋艷玲， 杜新春， 龐 穎， 殷連保， 張 毅， 戴宏斌

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

獨(dú)角蓮(TyphoniumgiganteumEngl.) 為天南星科(Araceae) 犁頭尖屬(Typhonium Schott) 植物,是中國(guó)特有的一種植物，主要產(chǎn)于河南、四川、陜西等地，現(xiàn)全國(guó)各地亦多栽培，東北地區(qū)產(chǎn)量極高，且價(jià)格較低廉.《民間草藥》、《中藥大辭典》記載，獨(dú)角蓮球莖供藥用，逐寒濕，祛風(fēng)痰，鎮(zhèn)痙，治中風(fēng)痰壅、口眼歪斜、破傷風(fēng)、跌打損傷、淋巴結(jié)核[1].迄今為止，對(duì)這種植物的使用多用于民間偏方，其有效活性成分的研究及應(yīng)用仍處于開(kāi)發(fā)階段.文獻(xiàn)報(bào)道，獨(dú)角蓮水提物對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)具有明顯的抑制作用[2-5].酪氨酸激酶在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中具有十分重要的作用，它和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系，成為目前抗腫瘤藥物的重要研究靶點(diǎn)[6-7].本實(shí)驗(yàn)對(duì)獨(dú)角蓮采用水提法提取，測(cè)定獨(dú)角蓮在不同提取工藝條件下的提取物對(duì)酪氨酸酶活性的相對(duì)抑制率,從中篩選出最佳的提取工藝.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

721型分光光度計(jì)；DF1015-集熱式磁力加熱攪拌器；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵；電子分析天平.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

獨(dú)角蓮鮮球根莖(市售，產(chǎn)地為吉林)洗凈，切成約5 mm的厚片， 經(jīng)50 ℃烘干，粉碎,過(guò)100目篩，備用；L-酪氨酸(上海伯奧生物科技有限公司)；酪氨酸激酶(上海江萊生物科技有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 獨(dú)角蓮水提物的提取工藝研究

利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，選取提取時(shí)間A、料液比B、提取溫度C、提取次數(shù)D作為4個(gè)考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，按照L9(34)正交表(表1)進(jìn)行試驗(yàn).以1號(hào)實(shí)驗(yàn)為例，稱取獨(dú)角蓮粗粉50 g，置圓底燒瓶?jī)?nèi)，用5倍質(zhì)量比的蒸餾水，在50 ℃提取1 h，提取次數(shù)1次.提取結(jié)束后，將提取液減壓濃縮至干,置烘箱中干燥至恒質(zhì)量,得干浸膏.其余試驗(yàn)按正交表設(shè)定的條件依次進(jìn)行.

表1 獨(dú)角蓮水提物提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2 酪氨酸酶抑制活性測(cè)定

Folin試劑可與酪氨酸的酚羥基作用生成深藍(lán)色化合物，該物質(zhì)可以用比色法測(cè)定.酪氨酸如果被酪氨酸激酶分解，將不能與福林試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)得的混合液的吸光度會(huì)有所降低.由于酶抑制劑的抑制活性不同，所形成的藍(lán)色化合物量不同，通過(guò)測(cè)定吸光度的變化可計(jì)算樣品對(duì)酪氨酸酶的抑制率.將上述各次提取實(shí)驗(yàn)所得到的浸膏分別稱取10 mg置于10 mL容量瓶中，分別加蒸餾水溶解并稀釋至質(zhì)量濃度為1 g/L，備用.取1 mg酪氨酸酶用磷酸緩沖液稀釋至5 mL備用.準(zhǔn)確吸取pH6.8磷酸鹽緩沖液1 mL、摩爾分?jǐn)?shù)為0.2 %酪氨酸溶液1 mL及Folin試劑，開(kāi)始反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)在37 ℃的恒溫中持續(xù)20 min，于680 nm 處測(cè)定吸光度A0.在上述實(shí)驗(yàn)條件下，再分別準(zhǔn)確吸取0.2 g/L酪氨酸酶試液1 mL、提取物樣品和0.2 g/L酪氨酸酶試液各1 mL、提取物樣品1 mL，分別進(jìn)行反應(yīng)后對(duì)應(yīng)測(cè)定吸光度分別為A1、A2、A3.酪氨酸激酶的抑制活性可以按以下公式計(jì)算:

抑制率=[(A1-A0)-(A2-A3)]/(A1-A0)×100 %

式中:A0空白對(duì)照品所測(cè)的吸光度;A1添加酪氨酸酶混合液所測(cè)的吸光度;A2添加提取物和酶的混合液所測(cè)的吸光度;A3添加提取物樣品混合液所測(cè)的吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，從表2 得出最佳提取工藝條件為A3B3C2D1，即提取時(shí)間為3 h，料液質(zhì)量比為1∶15，提取溫度80 ℃，提取次數(shù)為1次的條件下，獨(dú)角蓮提取物對(duì)酪氨酸酶抑制活性較高.從表2中得到的極差大小可知:影響提取物抑制酪氨酸酶活性的主次因素順序?yàn)镃>B>D>A，即提取溫度的影響最顯著，其次為提取液用量，再次為提取次數(shù)，最后為提取時(shí)間.

按照正交試驗(yàn)結(jié)果所得到的最佳提取工藝條件，重復(fù)進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，表明此提取工藝合理，穩(wěn)定，可行.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

2.2 討 論

正交試驗(yàn)結(jié)果表明：提取溫度的控制對(duì)提取物抑制酪氨酸酶活性的影響較大.溫度較低(50 ℃)情況下，有可能不利于獨(dú)角蓮中有效活性成分的提取，影響提取物抑制酪氨酸酶活性.溫度過(guò)高(100 ℃)，提取物抑制率也有所下降，可能是由于高溫使得部分活性化合物分解.提取液用量在料液質(zhì)量比1∶5與1∶10之間對(duì)提取物抑制酪氨酸酶活性的影響較大，而對(duì)于料液質(zhì)量比1∶10與1∶15之間對(duì)提取物抑制酪氨酸酶活性的影響較微弱，一般情況下，可選用料液質(zhì)量比1∶10來(lái)減少資源的浪費(fèi).

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),利用水提法對(duì)獨(dú)角蓮活性成分進(jìn)行提取,并進(jìn)行了酪氨酸酶抑制活性研究.結(jié)果表明：提取時(shí)間為3 h，料液質(zhì)量比為1∶15，提取溫度80 ℃，提取次數(shù)為1次的條件下，獨(dú)角蓮水提物抑制酪氨酸酶活性最強(qiáng)，抑制率為46.93 %.通過(guò)3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證了該提取工藝的優(yōu)化性.獨(dú)角蓮水提物作為一種有效的酪氨酸酶抑制劑，具有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的價(jià)值.

參考文獻(xiàn)：

[1] 侯家玉.中藥藥理學(xué)[M].2版.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2006:106.

[2] 王順肩,倪虹,王娟,等.獨(dú)角蓮對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制作用機(jī)理的研究[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志,2003,25(3):185-187.

[3] 王順啟,倪虹,王問(wèn)順,等.獨(dú)角蓮水提取物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721基因表達(dá)的影響[J].中草藥,2006,37(9):1384-1387.

[4] 王林美,葉博,趙振軍,等.獨(dú)角蓮抑制乳腺癌 MCF-7細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用研究[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(2):174-177.

[5] 尹建元,樸春姬,楊建增,等.禹白附抗腫瘤活性研究Ⅰ[J].長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,16(2):52-53.

[6] 劉振凱,艾菁,耿美玉.酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物研究方法進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,10(16):3134-3137.

[7] 姜秋紅,程能能,高慧君.以酪氨酸激酶信號(hào)通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志,2011,20(6):379-383.