Ta6－SFT基因?qū)τ筒说霓D(zhuǎn)化及抗旱性分析

李淑潔，張正英

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院科研管理處，甘肅 蘭州730070）

油菜（Brassicanapus）是我國最重要的油料作物，它不僅是食用油的主要來源，也是解決全球能源短缺的重要原料作物。油菜是需水作物，尤其是在抽薹以后，對水分需求更加旺盛和敏感。而油菜種植區(qū)頻繁發(fā)生的季節(jié)性干旱對油菜產(chǎn)量造成巨大的影響。通過研究植物抗旱機制，利用基因工程技術(shù)選育抗旱的油菜新種質(zhì)，是現(xiàn)在和以后油菜生物技術(shù)育種的重要組成部分。

果聚糖是一種以蔗糖為底物由果聚糖轉(zhuǎn)移酶基因催化合成的果糖基聚合物，它不僅是一種重要的貯藏性碳水化合物，也是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其分解產(chǎn)生的單糖能夠提高液泡溶質(zhì)濃度，增強植物對多種不良環(huán)境脅迫的抗性。在細菌中，只有果聚糖蔗糖酶參與果聚糖的合成；在植物中，果聚糖的合成以蔗糖為底物進行合成，主要的酶有1－SST（蔗糖：蔗糖1－果糖基轉(zhuǎn)移酶）、1－FFT（果聚糖：果聚糖1－果糖基轉(zhuǎn)移酶）、6－SFT（蔗糖：果聚糖－6－果糖基轉(zhuǎn)移酶），產(chǎn)物主要儲存于細胞液泡中。

研究證實，果聚糖代謝是植物抵抗逆境脅迫的途徑之一，它的積累可以使植物在干旱、低溫等多種脅迫下的抗逆性增強?？莶菅挎邨U菌（Bacillussubtilis）來源的果聚糖蔗糖酶基因（sacB）是較早克隆的基因。Van der Meerl等［1］將sacB導入非果聚糖積累型的馬鈴薯（Solanumtuberosum）中，轉(zhuǎn)基因植株的葉片和小塊莖內(nèi)均有相當量的果聚糖積累，改變了馬鈴薯植株原有的碳分配模式。Ebstkamp等［2］將sacB導入煙草（Nicotiana tabacum）植株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中果聚糖的積累能明顯提高植株的抗旱性。植物來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因相繼從大麥（Hordeumvulgare）［3］、小 麥 （Triticumaestivum）［4－5］、菜 薊 （Cynarascolymus）［6－7］、菊 芋 （Helianthustuberosus）［8－9］等物種中分離出來，并在煙草、馬鈴薯、牽?；ǎ≒harhirisnilqianniuhua）、菊苣（Cichoriumintybus）和甜菜（Betavulgaris）中進行了轉(zhuǎn)化。Hellwege等［7］將來自菜薊的1－SST和1－FFT轉(zhuǎn)入馬鈴薯，在收獲的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中檢測到了聚合度較高的菊糖型果聚糖，果聚糖代謝途徑的引入，不僅轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗旱性明顯提高，而且植物體內(nèi)的脯氨酸含量也顯著增加。李慧娟等［10］從萵苣（Lactucasativa）中克隆1－SST并導入煙草，抗旱性試驗表明1－SST提高了煙草轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性，同時轉(zhuǎn)1－SST煙草抗凍性也明顯提高。張小蕓等［11］將從冰草（Agropyroncristatum）中克隆的Ac1－FFT導入黑麥草（Loliumperenne），轉(zhuǎn)基因黑麥草株系中的可溶性總糖含量和果聚糖含量明顯高于對照植株，耐旱性提高。

果聚糖合成酶基因?qū)胗筒说难芯窟€未見報道。本研究將從抗旱小麥品種揚麥6號中克隆的蔗糖：果聚糖－6－果糖基轉(zhuǎn)移酶基因（Ta6－SFT）導入綜合性狀優(yōu)良的甘藍型油菜自交系材料，通過rd29A啟動子的調(diào)控使Ta6－SFT在轉(zhuǎn)基因油菜中逆境誘導型表達，研究Ta6－SFT在轉(zhuǎn)基因植株正常條件和干旱脅迫下的表達特性，以及由此引起的轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)果聚糖含量和相關生理指標變化，分析Ta6－SFT對轉(zhuǎn)基因油菜抗旱的作用，探討通過分子手段培育抗旱性油菜新品種的可行性，為改良油菜品質(zhì)，提高油菜抗旱性和擴大其栽培范圍奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜自交系材料1號、2號、5號為甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所油菜育種組提供。Ta6－SFT、rd29A啟動子分別由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所葉興國博士和甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學院司懷軍博士惠贈。植物表達載體 pCAMBIA－rd29A－6－SFT由課題組構(gòu)建（圖1），大腸桿菌（Escherichiacoli）菌株DH5a、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株LBA4404為甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所實驗室保存。

圖1 pCAMBIA－rd29A－6－SFT植物表達載體結(jié)構(gòu)簡圖Fig.1 Sketch of plasmid pCAMBIA－rd29A－6－SFT

1.2 Ta6－SFT 對油菜的轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌的活化、子葉預培養(yǎng)、農(nóng)桿菌浸染、共培養(yǎng)等實驗方法參照李淑潔等［12］的方法。

將經(jīng)過共培養(yǎng)的外植體首先用10mg/L草胺膦（以下簡稱ppt）選擇培養(yǎng)2～3周后，將分化出的抗性不定芽和抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入附加有ppt 15mg/L的分化培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選。待不定芽長到1cm以上時，切下并接入生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，2周左右長出不定根。

1.3 轉(zhuǎn)基因工程植株分子檢測

提取抗性植株基因組DNA，以含Ta6－SFT質(zhì)粒DNA為陽性對照，未轉(zhuǎn)化植株為陰性對照，用Ta6－SFT特異引物進行PCR擴增以檢測抗性植株中目的基因是否整合。PCR引物序列為：上游引物5′－CTGGATATCATGGGGTCACACGGCAAGCC－3′，下游引物5′－GGACTAGTTCATTGAACATACGAGTGATC－3′，PCR擴增參數(shù)為94℃，5min；94℃，45s；68℃，2min，35次循環(huán)；72℃，10min。PCR產(chǎn)物長度為1851bp。

Southern雜交以地高辛標記的Ta6－SFT全長為DNA探針，Hind III酶切PCR檢測陽性的轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA，參照Roche公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection starter KitⅠ（貨號：11745832001）說明書操作。Northern斑點雜交以Ta6－SFT全長為DNA探針，將Southern雜交呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株的總RNA變性后固定在尼龍膜上，雜交、免疫檢測等步驟同Southern雜交。

1.4 T1代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

收獲Southern雜交和Northern斑點雜交均呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株種子，按株系種植于轉(zhuǎn)基因溫室試驗田。等T1代轉(zhuǎn)基因植株長至3～4片真葉時，以25mg/L的ppt進行涂抹篩選，提取抗性植株基因組DNA，用Ta6－SFT特異引物進行PCR檢測。統(tǒng)計25mg/L ppt作為篩選濃度的陽性率，陽性率＝（PCR檢測陽性株數(shù)/抗性植株總數(shù)）×100% 。

1.5 T1代轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性分析

轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性試驗于2013年6月在甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所轉(zhuǎn)基因?qū)Ｓ脺厥覂?nèi)進行。取長勢一致的PCR檢測陽性的5－7株系的7株 T1代轉(zhuǎn)基因植株（編號分別為5－7－11，5－7－14，5－7－15，5－7－16，5－7－22，5－7－24和5－7－26，簡寫為11，14，15，16，22，24和26）進行干旱脅迫處理。參試植株生長于同一塊試驗地內(nèi)，進行統(tǒng)一管理。苗期正常澆水，進入抽薹期時停止?jié)菜_始干旱脅迫，36d后復水。分析干旱脅迫36d和復水后2d各植株中Ta6－SFT的轉(zhuǎn)錄水平差異。測定同時期各轉(zhuǎn)基因植株的果聚糖含量、丙二醛含量和細胞質(zhì)膜透性。

提取干旱脅迫36d和復水后2d各轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖~片總RNA，參照Invitrogen GoldScript cDNA合成試劑盒（貨號：c81401190）合成cDNA第一鏈。以油菜actin為內(nèi)參基因，采用半定量RT－PCR分析Ta6－SFT在干旱脅迫不同時期的轉(zhuǎn)錄水平表達。油菜actin基因上游引物5′－ATGGCCGATGGTGAGGACATTC－3′，下游引物5′－GGTGCGACCACCTTGATCTTC－3′。Ta6－SFT引物同前。

取干旱脅迫36d和復水后2d各轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ胀蝗~位葉片，利用GENMED植物果聚糖化學比色法定量檢測試劑盒（貨號：GMS19023.1v.A）測定果聚糖含量，參照《植物生理學實驗指導》電導法測定細胞質(zhì)膜透性和硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA含量［13］。每個指標測定做3次重復。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel軟件繪圖，并用DPS 7.05軟件利用SSR法進行多重比較。

圖2 轉(zhuǎn)基因油菜植株的PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR detection results of transgenic plants

2 結(jié)果與分析

2.1 T0代轉(zhuǎn)基因油菜的分子檢測

進行了Ta6－SFT對油菜5個純系材料的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得PCR檢測的3個純系的轉(zhuǎn)基因植株26株，各品系分別為：1號2株（編號1－1，1－2），2號10株（編號2－1，2－2，……，2－10），5號14株（編號5－1，5－2，……，5－14）（圖2）。Southern雜交分析了11份T0代轉(zhuǎn)基因油菜植株，確定其中8株中Ta6－SFT已整合進油菜基因組中（圖3），Northern斑點雜交確定其中7株中Ta6－SFT得到了轉(zhuǎn)錄 （圖4）。

圖3 轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交部分結(jié)果Fig.3 Southern blot of transgenic plants

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的Northern斑點雜交Fig.4 Northern dot blot of transgenic plants

2.2 T1代轉(zhuǎn)基因植株的草胺膦抗性篩選和PCR檢測

以ppt 25mg/L為涂抹濃度，7個轉(zhuǎn)基因株系篩選出89株抗性植株，PCR檢測有16株中擴增出1851bp的Ta6－SFT（圖5）目的基因。25mg/L ppt作為篩選濃度的陽性率為17.9%。

2.3 T1代轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性分析

2.3.1 干旱脅迫時轉(zhuǎn)基因植株中Ta6－SFT轉(zhuǎn)錄水平的表達分析 干旱脅迫36d時，Ta6－SFT在各轉(zhuǎn)基因植株中的表達水平不一致，其中11、15、16和26中表達水平高于其他轉(zhuǎn)基因植株，未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩袥]有Ta6－SFT的表達；復水2d后，各植株中Ta6－SFT基因的表達基本一致，都是微量表達（圖6），這與逆境誘導型的rd29A啟動子的功能相一致。

2.3.2 干旱脅迫時轉(zhuǎn)基因植株中果聚糖含量變化 與Ta6－SFT表達相對應地，在干旱脅迫36d時，11、15、16和26的果聚糖含量高于其他轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，?6最高（33.4mg/g），其次是15（28.8mg/g）、26（27.9mg/g）和11（27.0mg/g），14（18.0mg/g）、22（19.6mg/g）和24（18.5mg/g）果聚糖含量相對較低。復水2d后，各轉(zhuǎn)基因植株中Ta6－SFT都有微量表達，但果聚糖含量并沒有相應地降低卻有小幅升高（圖7），推測可能是與果聚糖積累和代謝反應速度有關。不論是干旱脅迫36d還是復水后2d，各轉(zhuǎn)基因葉片內(nèi)的果聚糖含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，具有極顯著差異。

2.3.3 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因植株相對電導率和丙二醛含量的影響 干旱脅迫36d時各轉(zhuǎn)基因植株的相對電導率低于對照，其中15、16、26和11的電導率與對照形成極顯著差異，說明這些轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下的細胞膜穩(wěn)定性較好，膜結(jié)構(gòu)沒有受到嚴重的破壞。這與同時期的果聚糖含量相反，說明干旱脅迫下果聚糖含量高的轉(zhuǎn)基因植株的細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性相對較好。復水后，各植株包括未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏南鄬﹄妼蚀蠓档?，各轉(zhuǎn)基因植株的相對電導率仍低于對照（圖8）。

圖5 T1代轉(zhuǎn)基因油菜植株的PCR分析電泳圖Fig.5 PCR detection results of transgenic plants of T1generation

圖6 干旱脅迫時轉(zhuǎn)基因油菜半定量RT－PCR分析Fig.6 Semi－quantitative RT－PCR of transgenic plants under drought stress

圖7 干旱脅迫對油菜轉(zhuǎn)基因植株果聚糖含量的影響Fig.7 Fructan concentration of the transgenic plants under drought stress

圖8 干旱脅迫對油菜轉(zhuǎn)基因植株相對電導率的影響Fig.8 Relative conductivity of transgenic plants under drought stress

干旱脅迫36d和復水2d時各轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量均顯著低于對照，具有極顯著差異。復水2d后，各植株包括未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏谋┖孔兓霈F(xiàn)兩種不同趨勢，對照、22、24和26復水后丙二醛含量持續(xù)上升，11、14、15、16復水后丙二醛含量小幅降低（圖9）。分析原因有可能是與丙二醛對逆境的響應慢有關。

圖9 干旱脅迫對油菜轉(zhuǎn)基因植株丙二醛含量的影響Fig.9 MDA content of transgenic plants under drought stress

3 討論

在果聚糖轉(zhuǎn)基因研究中，無論細菌來源的果聚糖蔗糖酶基因（sacB）還是植物來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因（1－SST，1－FFT，6－SFT，6G－SFT），在轉(zhuǎn)入植物 體內(nèi)表達后都檢測到了很低濃度的果聚糖積累。為了提高轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)果聚糖含量，研究者采用了各種方法以增強基因表達水平，如采用翻譯增強子A1MV RNA4與 CaMV 35S啟動子串聯(lián)［14］，玉米（Zeamays）ubiquitin啟動子驅(qū)動目的基因［15］，B33塊莖特異性啟動子［16］等特異性啟動子，還有在果聚糖合成酶基因前加入各種類型的亞細胞定位序列等，但都沒有取得顯著效果。Caimi等［17］曾將果糖基轉(zhuǎn)移酶基因置于化學誘導性啟動子控制下，雖然葉片中果聚糖的含量顯著提高了，但植物組織結(jié)構(gòu)在36h內(nèi)逐漸破壞。所以，普遍認為，只有低水平表達果聚糖的轉(zhuǎn)基因植株才能存活，高含量的果聚糖對轉(zhuǎn)基因植株具有致死效應［18］。推測這可能與果聚糖合成的底物是蔗糖有很大關系。蔗糖是光合作用的重要產(chǎn)物，是多數(shù)植物體內(nèi)長距離運輸碳水化合物的主要形式，是果聚糖合成的唯一底物。如果在植物體內(nèi)無限制的合成果聚糖，勢必會影響植物體內(nèi)碳代謝的其他途徑。在本研究中，為了發(fā)揮果聚糖在植物遭受逆境時的作用而又不造成物質(zhì)能量的無為消耗和對受體植物的傷害，Ta6－SFT被置于逆境誘導型的rd29A啟動子控制下。干旱脅迫36d時，各轉(zhuǎn)基因植株中Ta6－SFT基因活躍轉(zhuǎn)錄，11、15、16和26的轉(zhuǎn)錄水平高于其他轉(zhuǎn)基因植株，未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩袥]有Ta6－SFT的轉(zhuǎn)錄。復水2d后，各轉(zhuǎn)基因植株中Ta6－SFT基因都有微量表達，這與rd29A啟動子的轉(zhuǎn)錄特性相一致。本研究中轉(zhuǎn)基因油菜植株中都檢測到了果聚糖的積累（最高濃度為34.4mg/g），轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)和育性正常，未觀察到不良性狀，說明所選用的載體和啟動子能使目的基因在油菜中有效表達，對受體植物沒有產(chǎn)生不利影響。

高翔等［19］將從揚麥6號小麥品種中克隆出的果聚糖合成酶基因Ta6－SFT轉(zhuǎn)入煙草，并對轉(zhuǎn)基因植株進行了抗旱、抗鹽和抗低溫鑒定，轉(zhuǎn)Ta6－SFT的煙草植株表現(xiàn)出較強的抗旱、抗鹽和抗低溫能力。殷桂香等［20］進一步討論了植物中FBEs（果聚糖合成酶基因）結(jié)構(gòu)特點，分析了小麥中FBEs的拷貝數(shù)、染色體定位及亞細胞定位等，并對小麥Ta6－SFT進行了亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)液泡中存在其定位信號。Bie等［21］將Ta6－SFT、Ta1－SST和 Ta1－FFT，共轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)單基因（Ta1－SST、Ta1－FFT、Ta6－SFT）、雙基因（Ta1－SST＋Ta1－FFT、Ta1－SST＋Ta6－SFT、Ta1－FFT＋Ta6－SFT）和三基因（Ta1－SST＋Ta1－FFT＋Ta6－SFT）植株，進行抗逆鑒定和生理指標測定分析，結(jié)果證明共表達Ta1－SST＋Ta6－SFT的轉(zhuǎn)基因煙草中果聚糖含量高于這3個任意一單個基因或其他任兩個或三個基因組合，但轉(zhuǎn)化單個小麥果聚糖合成酶基因與轉(zhuǎn)化多個小麥果聚糖合成酶基因在提高煙草植株抗旱性方面無明顯差異。葉興國等［22］研究發(fā)現(xiàn)果聚糖的有效積累可提高小麥的抗旱能力，在水分脅迫處理前15d內(nèi)果聚糖積累量較低，水分脅迫21～28d果聚糖開始積累，隨著復水后干旱脅迫解除，果聚糖含量下降。李淑潔等［23］將rd29A啟動子驅(qū)動的Ta6－SFT的轉(zhuǎn)基因煙草株系和CaMV 35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因株系進行為期18d的干旱脅迫，分析了干旱脅迫0d和干旱脅迫18d不同轉(zhuǎn)基因株系中Ta6－SFT的轉(zhuǎn)錄水平表達差異，果聚糖含量以及抗旱相關生理指標，確定rd29A啟動子驅(qū)動的Ta6－SFT的轉(zhuǎn)基因煙草株系比CaMV 35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因株系更抗旱。本研究以rd29A啟動子驅(qū)動的Ta6－SFT進行油菜的轉(zhuǎn)化，獲得的轉(zhuǎn)Ta6－SFT的T1代轉(zhuǎn)基因油菜植株的果聚糖含量與其抗旱性呈正相關，即果聚糖含量高的植株受到的干旱脅迫相對較小，可能植物果聚糖含量在一定濃度范圍內(nèi)（可稱之為有效濃度）即可起到減輕干旱脅迫的作用。

在干旱脅迫下，植物代謝發(fā)生紊亂，體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的代謝平衡被破壞，植物細胞內(nèi)積累大量活性氧并引發(fā)膜脂過氧化，造成膜系統(tǒng)的損傷及膜脂過氧化程度的加劇。相對電導率和丙二醛含量常用來判斷植物受脅迫時細胞膜的穩(wěn)定性和受損傷程度。俞樂等［24］通過比較干旱脅迫不同時期細葉結(jié)縷草（Zoysiatenuifolia）和日本結(jié)縷草（Zoysiajaponica）的葉片相對含水量、電導率和丙二醛含量變化，得出細葉結(jié)縷草在干旱脅迫下葉片細胞膜受損程度較小，細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相對較強，對干旱脅迫的適應能力較強。賈學靜等［25］研究了干旱脅迫對金心吊蘭（Chlorophytumcapensevar.medio－pictum）葉片活性氧及其清除系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)當金心吊蘭體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除系統(tǒng)之間的平衡被破壞后，作為膜脂過氧化產(chǎn)物的MDA含量急劇上升。李州等［14］研究不同葉型白三葉（Trifoliumrepens）抗氧化保護及滲透調(diào)節(jié)生理對干旱脅迫的響應，認為小葉型白三葉比大葉型之所以具有較好的抗旱性，一方面在于它在干旱脅迫過程中具有良好的清除氧脅迫的能力，另一方面是它能夠保持相對較高的滲透調(diào)節(jié)作用。本研究中轉(zhuǎn)基因植株11、14、15和26在干旱脅迫36d時果聚糖含量高于其他轉(zhuǎn)基因植株，同時期相對電導率和丙二醛含量也較低，說明果聚糖含量高的轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫時細胞膜穩(wěn)定性好，膜損傷小，推測果聚糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在其響應干旱的過程中發(fā)揮了作用。

4 結(jié)論

果聚糖是Ta6－SFT的表達產(chǎn)物，為了發(fā)揮果聚糖在植物遭受逆境時的作用而又不造成物質(zhì)能量的無為消耗和對受體植物的傷害，本研究進行了rd29A啟動子驅(qū)動的Ta6－SFT對甘藍型油菜純系材料的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得經(jīng)PCR、Southern雜交和Northern斑點雜交驗證的轉(zhuǎn)基因植株。對7株T1代轉(zhuǎn)基因油菜進行了為期36d的干旱脅迫，分析干旱脅迫36d和復水后2d各植株及野生型對照中的Ta6－SFT的轉(zhuǎn)錄水平表達和果聚糖含量，同時進行同時期丙二醛含量和細胞質(zhì)膜透性測定。結(jié)果表明，Ta6－SFT的轉(zhuǎn)錄水平表達與轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的果聚糖含量、轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性呈正相關，表明Ta6－SFT在干旱脅迫下的表達增強了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。

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