甲狀腺毒癥大鼠心肌重構(gòu)與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的關(guān)系

王文鋒

(商洛市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 商洛 726000)

甲狀腺激素與人體的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝密切相關(guān)。各種原因?qū)е录谞钕偌に剡^(guò)多的釋放入血，可對(duì)心血管系統(tǒng)造成損害。其基本機(jī)制是交感神經(jīng)活性增強(qiáng)與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin angiotensin aldosterone system，RAAS)的啟動(dòng)[1-3]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是人體正常組織器官中具有多種生物學(xué)功能的多肽生長(zhǎng)因子，主要刺激多種間質(zhì)來(lái)源和神經(jīng)外胚層來(lái)源細(xì)胞的分化增殖和趨化，病理情況下也可由血管平滑肌細(xì)胞及粥樣斑塊中的壞死細(xì)胞產(chǎn)生,參與心肌缺血和梗死后的組織修復(fù)，在心血管疾病的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重大的作用[4-5]。本研究通過(guò)測(cè)定甲狀腺毒癥大鼠心肌bFGF水平變化，探討其在甲狀腺毒癥心血管損害中的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組及模型制備 45只成年雄性SD大鼠(購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，無(wú)特定病原體級(jí)別，體質(zhì)量260～330 g，于室溫(21±3) ℃、相對(duì)濕度(55±5)%條件下顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后按完全隨機(jī)法分為兩組：對(duì)照組22只，給予生理鹽水5 mL/kg灌胃；甲狀腺毒癥模型組23只，給予左旋甲狀腺素鈉0.5 mg/kg灌胃。對(duì)照組體質(zhì)量(274±30) g，甲狀腺毒癥模型組體質(zhì)量(278±20) g,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。每日灌胃1次，4周后用3%戊巴比妥鈉按照10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈抽血5～6 mL，在4℃低溫以1350×g，3000 r/min、離心10 min，汲取上層血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備 左旋甲狀腺素鈉：Merk KgaA,Germany；放射免疫固相微球分離三碘甲狀腺原氨酸總量(total tri-iodothyronine,TT3)、甲狀腺素總量(total thyroxine,TT4)試劑盒：貨號(hào) IMK439/IMK440,北京原子股份有限公司生產(chǎn)；促甲狀腺素(thyroid-stimulting hormone，TSH)免疫放射分析試劑盒：天津市協(xié)和科技有限公司生產(chǎn)；bFGF一抗：兔抗鼠-rat bFGF，北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；親和純化抗體(羊抗兔)，標(biāo)記長(zhǎng)臂生物素，效價(jià)1∶100～1∶200；GC400γ放射免疫計(jì)數(shù)器：合肥科大創(chuàng)新生產(chǎn)。

1.3血清TT3、TT4、TSH的測(cè)定 TT3、TT4放射免疫試劑盒(固相微球分離法)中自帶空白對(duì)照管、標(biāo)準(zhǔn)管及樣品管，空白對(duì)照管中加入125I-T3/125I-T4200 μL，標(biāo)準(zhǔn)管中依次加入濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液50 μL、125I-T3/125I-T4200 μL、T3/T4微球抗體 200 μL，樣品管依次加入血清樣品50 μL 、125I-T3/125I-T4200 μL、T3/T4微球抗體200 μL，經(jīng)溫育、低溫離心后棄去上清，置于GC400γ放射免疫計(jì)數(shù)儀中測(cè)定沉淀放射性計(jì)數(shù)60 s，預(yù)設(shè)為四參數(shù)方程曲線擬合方式，依據(jù)各管放射性計(jì)數(shù)計(jì)算出放射性碘的結(jié)合率，所以測(cè)得的結(jié)合率與樣品TT3或TT4的水平呈負(fù)相關(guān)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與結(jié)合率的關(guān)系按照四參數(shù)方程曲線擬合方式求得待測(cè)樣品的濃度。

采用TSH免疫放射分析試劑盒(一步夾心法)測(cè)定大鼠TSH，用單抗固相包被管預(yù)設(shè)質(zhì)控管、濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)管及樣品管。質(zhì)控管及樣品管中加入質(zhì)控液或血清200 μL、125I-TSH單抗50 μL，各標(biāo)準(zhǔn)管中依次加入濃度梯度的TSH標(biāo)準(zhǔn)品200 μL、125I-TSH 單抗50 μL，經(jīng)震蕩、洗滌后傾倒液體并吸干剩余水分，按照與測(cè)定TT3和TT4相似的方法求得血清樣品中TSH的濃度。

1.4心/體質(zhì)量比測(cè)量 抽血后于大鼠左心室內(nèi)注射1.34 mol/L氯化鉀使心臟停搏，取出心臟，沿動(dòng)靜脈根部剪去殘余血管，生理鹽水沖洗干凈后用清潔濾紙吸干水分，稱量心臟濕重，計(jì)算心臟與體質(zhì)量比，用心臟的毫克數(shù)與體質(zhì)量的百克數(shù)計(jì)算結(jié)果作為比值。

1.5心肌細(xì)胞直徑、膠原容積測(cè)定 剪取心臟左心室組織50～60 mg，置入10%甲醛固定24 h，經(jīng)過(guò)渡、脫水、透明、浸蠟包埋后切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色及Masson染色。使用CMIS-B型細(xì)胞醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量心肌細(xì)胞橫切面跨核處最長(zhǎng)直徑，單位為“μm”。每個(gè)視野下隨機(jī)測(cè)量10個(gè)細(xì)胞，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)移動(dòng)5個(gè)區(qū)域測(cè)量，求平均值。采集Masson染色圖像，分別測(cè)量膠原纖維面積及視野總面積，計(jì)算比值作為心肌膠原容積，膠原容積=每一視野膠原纖維面積/每一視野總面積，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)采集3個(gè)不同區(qū)域的圖像，求其平均值[6-7]。

1.6心肌bFGF測(cè)定 心肌石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，采用鏈霉親和素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶物法。經(jīng)常規(guī)脫蠟水化、修復(fù)、封閉、一抗孵育、二抗孵育，滴加鏈霉親和素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物，靜置、洗滌、顯色、復(fù)染后做脫水、透明處理，風(fēng)裱劑封片。用CMIS-B型細(xì)胞醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)400×鏡下隨機(jī)截取免疫組織化學(xué)切片圖像，每標(biāo)本隨機(jī)選10個(gè)位點(diǎn)測(cè)量陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物面積，然后取平均值。應(yīng)用圖像處理系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性產(chǎn)物灰度表示陽(yáng)性產(chǎn)物強(qiáng)度，灰度數(shù)值愈大(灰度層次愈小)則陽(yáng)性反應(yīng)物的反應(yīng)強(qiáng)度愈小。背景灰度測(cè)量值-陽(yáng)性物灰度測(cè)量值作為陽(yáng)性強(qiáng)度灰度值，陽(yáng)性反應(yīng)面積/測(cè)量面積×陽(yáng)性強(qiáng)度灰度值作為bFGF陽(yáng)性指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠一般情況比較 灌胃1周后甲狀腺毒癥模型組大鼠容易激惹，進(jìn)食及飲水顯著增加，伴有明顯的肌肉震顫、稀便及排便次數(shù)增加。4周后甲狀腺毒癥模型組大鼠脈率(414±25)次/min，較對(duì)照組(366±23)次/min升高(t=6.6，P<0.01)，收縮壓(139±4) mmHg，較對(duì)照組(121±7) mmHg升高(t=10.2,P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2兩組大鼠血清TT3、TT4、TSH水平比較 甲狀腺毒癥模型組大鼠血清TT3、TT4水平較對(duì)照組顯著升高；甲狀腺毒癥模型組大鼠血清TSH較對(duì)照組顯著降低(表1)。

表1 兩組大鼠血清TT3、TT4、TSH水平比較

組別只數(shù)TT3(mmol/L)TT4(mmol/L)TSH(mU/L)對(duì)照組 220.6±0.14.5±1.00.12±0.02甲狀腺毒癥模型組230.8±0.118.2±2.5 0.09±0.01t5.024.16.0P<0.01 <0.01 <0.01

TT3:三碘甲狀腺原氨酸總量; TT4:甲狀腺素總量; TSH:促甲狀腺素

2.3心/體質(zhì)量比、心肌細(xì)胞直徑、心肌膠原容積及心肌bFGF陽(yáng)性指數(shù)比較 甲狀腺毒癥模型組心/體質(zhì)量比較對(duì)照組顯著增加；心肌細(xì)胞直徑、心肌細(xì)胞膠原容積及bFGF陽(yáng)性指數(shù)較對(duì)照組顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

表2 兩組心/體質(zhì)量比、心肌細(xì)胞直徑、膠原容積及bFGF陽(yáng)性指數(shù)比較

組別只數(shù)心/體質(zhì)量比心肌細(xì)胞直徑(μm)心肌膠原容積(%)bFGF陽(yáng)性指數(shù)對(duì)照組 22260±3211.7±1.53.0±1.15.6±1.1甲狀腺毒癥模型組23335±21 15.0±1.6 8.9±0.7 18.3±1.4 t9.127.120.533.4P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01

bFGF: 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

3 討 論

心肌重構(gòu)是心臟對(duì)體內(nèi)外環(huán)境變化的適應(yīng)性反應(yīng)，包括功能重構(gòu)(早期重構(gòu))和結(jié)構(gòu)重構(gòu)(晚期重構(gòu))，與各種神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制激活有關(guān)，主要是交感系統(tǒng)與RAAS激活。甲狀腺毒癥引起的心肌重構(gòu)與交感神經(jīng)興奮性增加的關(guān)系已毋庸置疑，主要涉及早期的功能重構(gòu)，表現(xiàn)為快速性心律失常及外周循環(huán)的高動(dòng)力狀態(tài)，而在甲狀腺毒癥心肌損害的晚期結(jié)構(gòu)改變及心力衰竭與心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展中可能與RAAS機(jī)制關(guān)系密切。

本實(shí)驗(yàn)給予甲狀腺激素灌胃4周后，大鼠的心肌細(xì)胞直徑及膠原容積顯著增加，心肌細(xì)胞增粗，免疫組織化學(xué)見(jiàn)bFGF呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組少有bFGF表達(dá)。這一結(jié)果說(shuō)明甲狀腺毒癥大鼠心肌肥厚隨著bFGF表達(dá)的增高而增加，而bFGF可能是甲狀腺毒癥心肌肥厚的機(jī)制之一。何作云等[6]研究表明，二尖瓣關(guān)閉不全伴狹窄的壓力超負(fù)荷左心室肥大病，以及先天性心臟病(法洛氏四聯(lián)征或三聯(lián)征)患者容量超負(fù)荷的右心室肥大患者，其肥大心肌細(xì)胞中bFGF和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的信使RNA表達(dá)及其蛋白水平均顯著增加，證明bFGF可以在壓力超負(fù)荷及容量超負(fù)荷時(shí)表達(dá)增加，參與心肌肥厚的形成。目前已經(jīng)明確的bFGF表達(dá)增加的機(jī)制有：①外周血流量增加，血流加速，形成湍流，使血管壁內(nèi)皮細(xì)胞受到的剪切力增加，一氧化氮的表達(dá)增加，誘導(dǎo)內(nèi)生性bFGF；②心率加快、循環(huán)血量增多、壓力負(fù)荷增加等血流動(dòng)力學(xué)改變與心率依賴性的機(jī)械生長(zhǎng)因子表達(dá)增加可以介導(dǎo)心肌bFGF表達(dá)增加；③壓力超負(fù)荷及容量超負(fù)荷，引起RAAS機(jī)制激活，并上調(diào)心肌血管緊張素1受體的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞原癌基因C-myc信使RNA的過(guò)度表達(dá)，也可以增加bFGF的表達(dá)[9-11]。bFGF以自分泌及旁分泌方式，亦可通過(guò)胞內(nèi)分泌的方式——核轉(zhuǎn)位機(jī)制直接發(fā)揮其基因調(diào)控作用。bFGF可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞分化增殖與尿激酶型纖溶酶原激活物的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)展[12-13]。

綜上所述，甲狀腺毒癥心肌肥厚與bFGF的關(guān)系可以概括為交感激活，容量和(或)壓力超負(fù)荷，RAAS啟動(dòng)，bFGF表達(dá)增加，促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大與膠原纖維增生，導(dǎo)致心肌肥厚。這一發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)一步明確甲狀腺毒癥交感及RAAS激活導(dǎo)致心肌肥厚的機(jī)制，為甲狀腺毒癥心肌損害研究提供新的思路，提示甲狀腺毒癥早期改善血流動(dòng)力學(xué)的抗交感及抗RAAS治療相當(dāng)重要，如有可能，阻斷bFGF亦可為甲狀腺毒癥乃至其他原因引起心肌重構(gòu)的方法之一。

[1] Honda H,Iwata T,Matsuda H,etal.Comparison of muscarinic receptor-and beta-adrenoceptor-mediated vasorelaxation between euthyroid and acute hyperthyroid rats[J].Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol,2005,141(3):241-247.

[2] Patan S,Marte F.Atrial fibrillation associated with exogenous subclinical hyperthyroidism,changing axis deviation,troponin-I positive and without acute coronary syndrome[J].Int J Cardiol,2011,150(3):e85-e88.

[3] Fommei E.Iervasi G.The role of thyroid hormone in blood pressure homeostasis:evidence from short-term hypothyroidism in humans[J].J Clin Endocrinol Metab,2002,87(5):1996-2000.

[4] 胡丙杰,陳建國(guó),徐小虎,等.早期心肌梗死bFGF的免疫組化研究[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2000,16(4):205-207.

[5] 崔建奇,柳川，周延沖,等.成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子與心血管疾病[J].生理科學(xué)進(jìn)展,1994,25(1):76-79.

[6] Carneiro-Ramos M,Diniz GP,Nadu AP,etal.Blockage of Angiotensin II type 2 receptor prevents thyroxine-mediated cardiac hypertrophy by blocking Akt activation[J].Basic Res Cardiol,2010,105(3):325-335.

[7] Rentzsch B,Todiras M,Iliescu R,etal.Transgenic angiotensin-converting enzyme 2 overexpression in vessels of SHRSP rats reduces blood pressure and improves endothelial function[J].Hypertension,2008,52(5):967-973.

[8] 何作云,羅惠蘭,馮兵,等.血液動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷患者心肌肥大時(shí)bFGF,TGF-β1的變化[J].中國(guó)病理生理雜志,2000,16(10):994-995.

[9] Sah RL,Chen AC,Grodzinsky AJ,etal.Differential effects of bFGF and IGF-I on matrix metabolism in calf and adult bovine cartilage explants[J].Arch Biochem Biophys,1994,308(1):137-147.

[10] 張冬,任江華,曹茂銀.容量超負(fù)荷心肌肥大時(shí)局部心肌AngⅡ,bFGF的變化及ATI受體拮抗劑對(duì)其影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].心臟雜志,2002, 14(4):296-300.

[11] Fukuyama K,Ichiki T,Takeda K,etal.Downregulation of vascular angiotensin II type 1 receptor by thyroid hormone[J].Hypertension,2003,41(3):598-603.

[12] Ziche M,Parenti A,Ledda F,etal.Nitric oxide promotes proliferation and plasminogen activator production by coronary venular endothelium through endogenous bFGF[J].Circ Res,1997,80(6):845-852.

[13] Axelband F,Dias J,Ferr?o FM,etal.Nongenomic signaling pathways triggered by thyroid hormones and their metabolite 3-iodothyronamine on the cardiovascular system[J].J Cell Physiol,2011,226(1):21-28.