aiiA基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

歐陽樂軍，梁卓玲，黃真池，沙月娥，曾富華

(湛江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣東 湛江 524048)

研究表明，細(xì)菌間通過群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)系統(tǒng)實現(xiàn)信息交流，調(diào)控群體行為[1]。許多致病菌的QS系統(tǒng)利用N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHLs)為信號分子，據(jù)此人們試圖從植物或微生物中發(fā)現(xiàn)能編碼降解AHLs酶的基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育產(chǎn)生可降解AHLs的轉(zhuǎn)基因植物，破壞病原菌信號分子，從而猝滅植物病原菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)。研究表明，這種方法可有效減弱病原細(xì)菌致病力，提高植物的抗病能力[2]。病原菌群體猝滅基因(aiiA基因)表達(dá)產(chǎn)物為N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶(AHL-Lactonase)，是一種具有降解AHLs分子能力的特異性水解酶。AHL-Lactonase通過水解AHLs分子的內(nèi)酯鍵，可降低致病菌群中信號分子的活性，從而極大地減弱致病菌的危害能力[3]。通過構(gòu)建基因的原核表達(dá)載體，將外源基因在原核生物中表達(dá)后，提取其表達(dá)產(chǎn)物，從而進(jìn)一步鑒定其功能是目前基因功能研究常用的方法，但原核表達(dá)條件需不斷優(yōu)化，以提高表達(dá)量。歐陽樂軍等[4]在前期研究工作中，成功地從枯草芽孢桿菌亞種Bs-6菌株中克隆得到aiiA基因，其序列與已報道aiiA的同源性為87%～96%，并通過基因工程方法構(gòu)建了克隆載體pMDTM19-T Vector+aiiA。在此基礎(chǔ)上，本研究將pMDTM19-T Vector+aiiA的aiiA基因雙酶切回收后，與經(jīng)同樣雙酶切的pGEX-4T-1相連，構(gòu)建其原核表達(dá)載體，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并檢測了表達(dá)產(chǎn)物的抑菌能力以及對病原菌致病力的影響，以期為利用基因工程手段培育轉(zhuǎn)aiiA基因植株以猝滅植物病原菌的QS系統(tǒng)，增加植物抗病能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

pMDTM19-T Vector+aiiA、原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1及青枯菌(R.solanacearum)、焦枯菌(C.quinqueseptatun)和桃色歐文氏桿菌由湛江師范學(xué)院植物工程中心實驗室保存；E.coliBL21購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA Ladder Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4-DNA ligase購自大連寶生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 方 法

1.2.1aiiA基因的獲取 采用生工生物工程(上海)有限公司質(zhì)粒純化試劑盒提取純化pMDTM19-T Vector+aiiA質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ對純化的pMDTM19-T Vector+aiiA進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下：10×K Buffer 8.0 μL，BamHⅠ(10 U/μL)3.0 μL，XhoⅠ(10 U/μL)3.0 μL，pMDTM19-T Vector+aiiA 6.0 μL，補(bǔ)充滅菌去離子水至30 μL。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，并用生工生物工程(上海)公司瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒回收aiiA基因目的片段，具體方法按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.2 pGEX-4T-1+aiiA原核表達(dá)載體的構(gòu)建及檢驗 采用生工生物工程(上海)有限公司質(zhì)粒純化試劑盒提取純化pGEX-4T-1質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ對純化的pGEX-4T-1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，再用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，并用生工生物工程(上海)公司瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒回收酶切大片段。按寶生物工程(大連)有限公司T4-DNA ligase操作說明，將1.2.1中經(jīng)過BamHⅠ 和XhoⅠ雙酶切的aiiA基因連接到經(jīng)過同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的BamHⅠ與XhoⅠ酶切位點間，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1+aiiA。連接體系如下：T4-DNA ligase Buffer 4.0 μL，pGEX-4T-1 2.0 μL，純化回收的aiiA片段6.0 μL，T4-DNA ligase (3 U/μL) 1.0 μL，補(bǔ)充滅菌去離子水至20 μL?；靹蚝笾?6 ℃連接12 h以上。取5 μL連接產(chǎn)物，用熱激法轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，具體方法參照E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化說明書進(jìn)行。

采用QIAGEN公司的質(zhì)粒純化試劑盒提取pGEX-4T-1+aiiA質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切驗證，具體酶切體系如下：10×K Buffer 8.0 μL，BamHⅠ(10 U/μL)3.0 μL，XhoⅠ(10 U/μL) 3.0 μL，pGEX-4T-1-aiiA 6.0 μL，補(bǔ)充滅菌去離子水至30 μL。將上述酶切體系各組分輕微離心混勻后，37 ℃酶切4 h以上。酶切結(jié)束后，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結(jié)果。

aiiA基因PCR檢測引物由生工生物公司合成,Primer 1：5′-ATCATGACAGTAAAGAAGCTTTATTTCG-3′；Primer 2:5′-GTCCTCAACAAGATACTCCTAATGATGT-3′。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μL，模板(1 ng/μL)1.0 μL，上游引物(10 μmol/mL) 1.0 μL，下游引物(10 μmol/mL) 1.0 μL，PremixTaq酶(2 U/μL)0.5 μL, 補(bǔ)充滅菌去離子水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。將酶切和PCR檢測呈陽性的載體送往生工生物公司測序。

1.2.3 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 取50 μL 1.2.2節(jié)中構(gòu)建的含pGEX-4T-1+aiiA質(zhì)粒的陽性重組菌，接種于5 mL LB培養(yǎng)液中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)。根據(jù)影響E.coli中可溶性靶蛋白表達(dá)量的因素，按表1設(shè)計L9(34)正交試驗，優(yōu)化影響可溶性靶蛋白表達(dá)量的因素。將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體用離心管收集后重懸于預(yù)冷的PBS溶液(含150 mmol/L NaCl、16 mmol/L Na2HPO4、4 mmol/L NaH2PO4，pH 7.3)中，用超聲破碎法破碎菌體4 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

表1 L9(34)正交試驗設(shè)計表

1.2.4 aiiA蛋白對病原菌致病力的影響 將桃色歐文氏桿菌制成1×107CFU/mL菌懸液，與等量aiiA蛋白表達(dá)上清液混合接種消毒后的馬鈴薯片，用未接種桃色歐文氏桿菌、只單獨(dú)接種桃色歐文氏桿菌以及接種桃色歐文氏桿菌+未誘導(dǎo)表達(dá)菌液的馬鈴薯片作為對照，將培養(yǎng)皿密封后置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，觀察馬鈴薯片的腐爛情況，并拍照記錄結(jié)果。

將1.2.3節(jié)中9號試驗的aiiA蛋白與青枯菌液混合后，以傷根接種法[5]接種尾巨桉，24 h后觀察植株病癥情況，以未加aiiA蛋白的青枯菌接種的尾巨桉為對照。

1.3 轉(zhuǎn)aiiA基因植株的獲得及抗性分析

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將aiiA基因轉(zhuǎn)入尾巨桉，選取分子檢測[5]呈陽性的植株接種焦枯菌后，調(diào)查植株的抗性。植株病情指數(shù)計算參照方仲達(dá)[6]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 aiiA基因的獲取

用BamHⅠ和XhoⅠ對純化的pMDTM19-T Vector+aiiA進(jìn)行雙酶切后，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，得到與預(yù)期長度一致的2條條帶，一條為目的基因aiiA，另一條為pMDTM19-T Vector大片段(圖1)?；厥誥iiA基因片段，用于原核表達(dá)載體的構(gòu)建。

2.2 aiiA基因原核表達(dá)載體的鑒定

提取重組質(zhì)粒pGEX-4T-1+aiiA后，用PCR檢測獲得了與aiiA基因長度一致的條帶(圖2-A)，BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切結(jié)果獲得了與預(yù)期長度相一致的2條條帶(圖2-B)。同時，重組質(zhì)粒pGEX-4T-1+aiiA測序結(jié)果證實，插入的外源目的基因序列與克隆載體中的aiiA基因序列一致。上述結(jié)果表明，原核表達(dá)載體pGEX-4T-1+aiiA構(gòu)建成功。

圖1 雙酶切pMDTM19-T Vector+aiiA質(zhì)粒獲取的aiiA基因

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1+aiiA的鑒定

2.3 pGEX-4T-1+aiiA誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

正交試驗結(jié)果表明，溫度是影響靶蛋白表達(dá)量的主要因素，當(dāng)溫度保持在37 ℃時，其他3個處理因素?zé)o論是否改變，都不影響靶蛋白的表達(dá)量，31 ℃時也出現(xiàn)相似的結(jié)果；而當(dāng)誘導(dǎo)溫度降至25 ℃時，靶蛋白的表達(dá)量最高，目的條帶的位置與融合蛋白的分子質(zhì)量54 ku (26 ku+27.5 ku)相當(dāng)(圖3)。

圖3 重組aiiA蛋白原核誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

2.4 aiiA蛋白的抗病性測定

2.4.1 對桃色歐文氏桿菌致病力的影響 由圖4可見，aiiA蛋白可以抑制桃色歐文氏桿菌對馬鈴薯的致病性，用aiiA蛋白上清液與桃色歐文氏桿菌一起接種后，馬鈴薯片腐爛程度明顯減輕，說明aiiA蛋白對桃色歐文氏桿菌引起的腐爛有較好的抑制效果，而未添加aiiA蛋白的馬鈴薯片腐爛明顯。

2.4.2 對青枯菌致病力的影響 尾巨桉接種青枯菌24 h后，對照植株表現(xiàn)出缺水跡象，植株萎蔫，葉片下垂，澆水不能減輕缺水癥狀；而接種青枯菌與aiiA蛋白混合液的尾巨桉植株形態(tài)正常，枝葉挺拔，無明顯的感病癥狀(圖5)，說明aiiA蛋白能有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生。

圖4 aiiA蛋白對桃色歐文氏桿菌致病力的影響

2.5 轉(zhuǎn)aiiA基因尾巨桉植株對焦枯菌抗性的檢測

尾巨桉接種焦枯菌3 d時，部分非轉(zhuǎn)基因植株葉片出現(xiàn)病斑，呈燙傷狀，少數(shù)葉片焦枯、皺縮、卷曲；枝條出現(xiàn)少數(shù)點狀病斑(圖6)；接種6 d時，非轉(zhuǎn)基因植株病情指數(shù)達(dá)到19.3%，12 d時達(dá)到 67.3%，16 d時為97.6%(圖7)。轉(zhuǎn)aiiA基因植株接種3 d時未見異常(圖6)，第6天時也未見異常，病情指數(shù)為0，接種16 d時病情指數(shù)為67.1%(圖7)。根據(jù)病情指數(shù)的大小可判定，轉(zhuǎn)aiiA基因尾巨桉較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓陮箍菥目剐悦黠@提高。

圖5 aiiA蛋白對青枯菌致病力的影響

圖7 轉(zhuǎn)aiiA基因植株接種焦枯菌后病情指數(shù)的變化

3 討論與結(jié)論

隨著群體感應(yīng)與病原菌致病關(guān)系研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌自身誘導(dǎo)物AHLs是病原菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的主要信號分子，AHLs濃度降低時不能激活病原菌致病基因的表達(dá)[7-8]。隨著此方面研究的深入，有望從植物或微生物中發(fā)現(xiàn)降解多種細(xì)菌群體感應(yīng)信號分子的酶，根據(jù)植物對細(xì)菌QS系統(tǒng)的反應(yīng)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育產(chǎn)生含AHLs降解酶的轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)而猝滅病菌的群體感應(yīng)，提高植物抗病性[9-11]。筆者在前期的研究中，從Bs-6菌株中克隆了aiiA基因，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，在線BLAST分析時發(fā)現(xiàn)，Bs-6的aiiA基因與GenBank中已報道的aiiA基因同源性達(dá)87%～96%，且推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為89.2%～98.4%，說明從Bs-6中成功克隆了aiiA基因，且該基因編碼的AHL-Lactonase具有降解AHLs分子的性質(zhì)，能夠起到猝滅革蘭氏陰性致病菌QS系統(tǒng)的作用。

原核生物表達(dá)系統(tǒng)中的E.coli表達(dá)系統(tǒng)具有高效性和穩(wěn)定性[12]，因而運(yùn)用最廣泛，其遺傳背景研究也最清楚。本研究應(yīng)用的表達(dá)載體pGEX-4T-1含有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)基因，能將外源基因表達(dá)為GST(分子質(zhì)量為26 ku)的融合蛋白，以增加外源目的蛋白的可溶性。據(jù)以往的報道可知，本研究中正交試驗設(shè)計的4個因素是影響E.coli中可溶性靶蛋白表達(dá)量的主要因素。其中誘導(dǎo)溫度對可溶性靶蛋白的表達(dá)量影響最為顯著；同時，誘導(dǎo)時間對可溶性靶蛋白的表達(dá)量也有很大的影響，隨著誘導(dǎo)時間的延長，靶蛋白的表達(dá)量增加；適宜濃度的Amp能提供一定的選擇壓力，增強(qiáng)pGEX-4T-1質(zhì)粒的穩(wěn)定性，以提高可溶性靶蛋白的表達(dá)量。本試驗結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度是最主要的影響因素，這與以往的報道結(jié)果是一致的。這主要是由于較低的生長溫度使蛋白質(zhì)的合成速度降低，同時，無活性聚集體的形成速率也降低，這些聚集體是疏水性的，相互作用較弱，從而可減少包涵體的形成[13]。本試驗對原核表達(dá)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，提高了可溶性靶蛋白的表達(dá)量，避免對包涵體蛋白質(zhì)進(jìn)行變性與復(fù)性處理過程，為后續(xù)外源蛋白活性測定奠定了基礎(chǔ)。

aiiA蛋白可以抑制桃色歐文氏桿菌對馬鈴薯的致病性，用aiiA蛋白上清液與致病菌一起接種后，馬鈴薯片的腐爛程度明顯減輕，說明aiiA蛋白對桃色歐文氏桿菌引起的腐爛有較好的抑制效果，降低病菌的致病力。同時，aiiA蛋白與青枯菌混合接種尾巨桉后，因aiiA蛋白能有效降低青枯菌的致病力，植株病癥的發(fā)生得到了延緩。利用病原菌信號分子群體猝滅機(jī)制以及植物抗病基因誘導(dǎo)表達(dá)策略，能顯著增強(qiáng)抗病基因的表達(dá)效率，從而將病原菌信號分子猝滅，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的廣譜抗性。本研究中，轉(zhuǎn)aiiA基因尾巨桉接種焦枯病菌后，抗性水平比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暧忻黠@提高，達(dá)到中等抗病水平。本研究結(jié)果對利用基因工程手段培育轉(zhuǎn)aiiA基因植物，從而通過猝滅植物病原菌群體感應(yīng)信號來破壞其QS系統(tǒng)，降低其致病力，提高植物的抗病害能力有一定的參考意義。

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