連翹苷對小鼠遺傳物質(zhì)的損傷作用

趙詠梅，張思琪

(西安文理學(xué)院 生物技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710065)

連翹(Forsythiasuspense(Thunb.))為木犀科連翹屬植物，是中國臨床常用傳統(tǒng)中藥之一。中醫(yī)認(rèn)為， 連翹根、莖、葉及果實(shí)皆可入藥，其味苦、性微寒，歸肺、心、膽經(jīng)，具有清熱解毒、散結(jié)消腫、疏散風(fēng)熱的功效。連翹苷是從連翹的干燥果實(shí)及葉中提取的主要活性物質(zhì)之一，在前期的研究中，筆者證實(shí)了連翹苷不僅具有清除自由基、減肥降血脂作用，還能夠抑制線粒體的氧化損傷[1-2]。同時，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，低劑量連翹苷可以抑制1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，增加細(xì)胞活性[3]。目前，連翹已廣泛用于炎癥、病毒、發(fā)燒、潰瘍的治療[4-8]，其存在的遺傳毒性也逐漸被人們所認(rèn)識。王虹等[9]認(rèn)為，高濃度的連翹水提物能明顯提高哺乳動物精子畸形率，連翹中另一重要活性物質(zhì)連翹酯苷對細(xì)胞的遺傳毒性和對小鼠的急性毒性作用也已得到證實(shí)[10-11]。然而關(guān)于連翹苷遺傳毒性的研究還未見報道。為了給臨床用藥提供依據(jù)，在前期研究的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)對連翹苷的遺傳毒性進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 動 物 ICR小鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2) g/只?；A(chǔ)飼料由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。試驗(yàn)前，小鼠在溫度為(23±3) ℃、相對濕度為 50%～70%的動物飼養(yǎng)室內(nèi)適應(yīng)喂養(yǎng)1周，12 h照明循環(huán)。

1.1.2 連翹苷 從采自秦嶺北麓藍(lán)田灞源段的連翹葉中提取的連翹苷，經(jīng)檢測純度達(dá)96%。試驗(yàn)前，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液溶解連翹苷，100 Hz超聲助溶。

1.1.3 主要儀器 DYY-6C細(xì)胞電泳儀、奧林巴斯BX-51熒光顯微鏡和SigmaTDL-5臺式高速離心機(jī)等。

1.2 方 法

1.2.1 連翹苷對小鼠的急性毒性 將小鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分組，每組6只，雌雄各半，依據(jù)半數(shù)致死量(LD50)計算的設(shè)計原則，分別腹腔注射不同劑量的連翹苷溶液0.5 mL/只(劑量分別為1 500，1 250，1 000，750，500和250 mg/kg)1次，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，連續(xù)觀察10 d，記錄小鼠的死亡數(shù)，以改良寇氏法[11]求LD50：

LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]。

式中:Xm為最大劑量組劑量的常用對數(shù)值;i為劑間比的常用對數(shù)值;p為各組死亡率。

1.2.2 連翹苷對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞的影響 將健康小鼠隨機(jī)分陽性對照組、陰性對照(溶劑)組及4個連翹苷染毒組，每組5～6只小鼠。陽性對照組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液0.5 mL/只，劑量為45 mg/kg，連續(xù)注射2 d，每天1次；陰性對照組小鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液0.5 mL/只，連續(xù)注射5 d，每天1次；連翹苷染毒組小鼠分別腹腔注射不同劑量的連翹苷0.5 mL/只(劑量分別為250，500，750和1 000 mg/kg)，連續(xù)注射5 d，每天1次。在最后一次給藥6 h后，將各組小鼠頸椎脫臼處死，取出股骨，常規(guī)方法收集小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞，經(jīng)涂片、固定和瑞氏染色，顯微鏡400倍下計數(shù)微核細(xì)胞數(shù)和總核異常細(xì)胞數(shù)。每試驗(yàn)組計數(shù)1 000個細(xì)胞，計算細(xì)胞微核率和總核異常細(xì)胞率。

1.2.3 連翹苷對小鼠肝細(xì)胞DNA的影響 取1.2.2 中給藥處理各組小鼠肝組織，取材大小為0.8 cm×(0.8～1.0) cm，剪碎，加入4～5滴PBS液混勻，以 1 000 r/min離心勻漿5 min，保留上清液。雙層制膠法準(zhǔn)備電泳試驗(yàn)，第一層膠用預(yù)熱質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.7%正常熔點(diǎn)膠，待其凝固后，將小鼠肝細(xì)胞與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%的低熔點(diǎn)瓊脂糖按體積比1∶4混勻作為第二層膠，鋪在第一層膠體的載玻片上，蓋上蓋玻片，4 ℃凝固。經(jīng)裂解、解旋后，在電壓18 V、電流300 mA條件下電泳20 min。經(jīng)蒸餾水中和、Goldview染液染色后，在熒光顯微鏡下用515～560 nm的激發(fā)光觀察，各組在400倍鏡下隨機(jī)選取 2 000 個細(xì)胞，觀測細(xì)胞拖尾圖像，統(tǒng)計拖尾細(xì)胞數(shù)，并計算拖尾細(xì)胞率。

1.2.4 連翹苷對小鼠精子細(xì)胞的影響 雄性小鼠分組及處理方法如1.2.2節(jié)。染毒后第10天處死小鼠，取出副睪，縱向剪開，浸泡于盛有1 mL生理鹽水的平皿中，靜置3 min后輕輕搖動。用四層擦鏡紙過濾，吸濾液涂片。經(jīng)干燥、甲醇固定、伊紅染色1 h后，在400倍鏡下檢查精子形態(tài)，計數(shù)頭尾結(jié)構(gòu)完整的精子。每只小鼠檢測1 000個精子。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹苷對小鼠的急性毒性

試驗(yàn)期間，經(jīng)1 000 mg/kg及以下劑量連翹苷染毒處理的各組小鼠均存活，無不良反應(yīng)或異常行為。10 d后測試表明，與對照組相比，各組小鼠體質(zhì)量無任何差異(數(shù)據(jù)未列出)。1 500和1 250 mg/kg 劑量連翹苷染毒組分別有3只和1只小鼠死亡；并且存活小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量變化，用改良寇氏法求得半數(shù)致死量LD50為1 086 mg/kg。

2.2 連翹苷對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞的影響

正常嗜多染紅細(xì)胞是由晚幼紅細(xì)胞將核排出后形成的無核細(xì)胞，如果晚幼紅細(xì)胞染色體發(fā)生突變就會在嗜多染紅細(xì)胞中產(chǎn)生微核并造成其他核異常。本試驗(yàn)中，經(jīng)連翹苷處理的嗜多染紅細(xì)胞有微核產(chǎn)生，典型的微核為圓形，邊緣整齊，在一個細(xì)胞內(nèi)有1個或多個微核，大小為主核的1/10～1/5(圖1-A)，或在有絲分裂中形成染色體斷裂片段(圖1-B)。總核異常包括形成微核、染色體斷裂、核空泡、核破碎等現(xiàn)象。經(jīng)對每試驗(yàn)組1 000個嗜多染紅細(xì)胞的觀察和計數(shù)，連翹苷對小鼠微核和總核異常的影響如表1所示。表1表明，隨著染毒劑量的增加，連翹苷染毒處理的各組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和總核異常率逐漸上升；與陰性對照組相比，500～1 000 mg/kg劑量組及環(huán)磷酰胺陽性對照組微核率和總核異常率均極顯著升高(P<0.01)。說明一定劑量的連翹苷可使小鼠細(xì)胞染色體發(fā)生突變，對其遺傳系統(tǒng)造成損傷。

圖1 連翹苷對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞的影響(400×)

表1 連翹苷對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率及總核異常率的影響(n=1 000)

2.3 連翹苷對小鼠肝細(xì)胞DNA的影響

染毒處理5 d后，經(jīng)彗星電泳試驗(yàn)，小鼠肝細(xì)胞的DNA拖尾率見表2。

表2 連翹苷對小鼠肝細(xì)胞DNA拖尾的影響(n=2 000)

表2表明，連翹苷染毒處理后，隨著染毒劑量的增加，各染毒組小鼠肝細(xì)胞DNA拖尾率與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且DNA拖尾率變化無明顯規(guī)律性；環(huán)磷酰胺組肝細(xì)胞DNA拖尾率與陰性對照組相比，差異極顯著(P<0.01)。說明在受試劑量下，連翹苷不會對小鼠肝細(xì)胞DNA造成損傷。

2.4 連翹苷對小鼠精子的影響

經(jīng)對每染毒劑量約6 000個精子細(xì)胞的觀察和計數(shù)，連翹苷對小鼠精子的影響如表3所示。表3顯示，隨著連翹苷染毒劑量的增加，各組小鼠精子畸形率逐漸上升；與陰性對照組相比，500～1 000 mg/kg 3個劑量組精子畸形率顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于陰性對照組，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，提示連翹苷在小鼠體內(nèi)對生殖細(xì)胞有致突變作用。畸形精子形態(tài)異常，主要表現(xiàn)在頭部，其次為尾部，畸形類型表現(xiàn)為香蕉形、無鉤、胖頭、雙尾、尾折疊、無定形等(圖2)。

表3 連翹苷對小鼠精子畸形率的影響(n=6 000)

圖2 連翹苷對小鼠精子的致畸作用(400×)

3 討 論

遺傳毒性研究是連翹苷非臨床安全性評價的重要內(nèi)容，通過對受試動物的體外和體內(nèi)試驗(yàn)，研究連翹苷直接或間接誘導(dǎo)遺傳學(xué)損傷的機(jī)制，是其進(jìn)入臨床試驗(yàn)及上市的重要環(huán)節(jié)。由于一種遺傳毒性檢測方法通常只能反映1個或2個遺傳學(xué)特征，不能覆蓋所有的遺傳學(xué)特征，故本研究在檢測連翹苷的遺傳毒性時，采用了互相補(bǔ)充的骨髓微核試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)，并對連翹苷的小鼠精子致突變作用進(jìn)行了檢測。

微核試驗(yàn)是檢測細(xì)胞核或染色體損傷的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法，微核率可以反映遺傳物質(zhì)受傷的程度。本研究表明，連翹苷劑量達(dá)500 mg/kg以上時，隨著劑量的增加，小鼠嗜多染紅細(xì)胞微核率上升，說明在連翹苷的作用下，嗜多染紅細(xì)胞在有絲分裂后期發(fā)生了染色體片段斷裂或染色體落后，這些斷裂的染色體片段或落后的染色體在末期單獨(dú)形成了1個或幾個規(guī)則的次核。表明一定劑量的連翹苷可使小鼠細(xì)胞染色體發(fā)生突變，具有一定的遺傳毒性。

彗星試驗(yàn)是一種檢測單個細(xì)胞DNA斷裂情況的技術(shù)，若細(xì)胞核受損，DNA的降解片段在電場中泳動遷移，經(jīng)染色后會看到類似彗星尾巴形狀指向陽極，呈現(xiàn)出特有的彗星拖尾圖像[12]，用該技術(shù)檢測連翹苷對DNA的損傷作用，更加快速、簡便、靈敏。研究結(jié)果顯示，連翹苷染毒處理下，小鼠肝細(xì)胞DNA斷裂數(shù)并未增加，拖尾率與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明在受試劑量下，連翹苷不會對小鼠肝細(xì)胞DNA造成損傷。

小鼠精子畸形試驗(yàn)可檢測環(huán)境因子對生殖細(xì)胞生成和發(fā)育的影響。已知精子的畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果，因此形態(tài)的改變提示有關(guān)基因及蛋白質(zhì)產(chǎn)物發(fā)生了改變[13]。連翹苷染毒處理使小鼠精子畸形率逐漸上升，表明連翹苷在雄性小鼠體內(nèi)對精子有致突變作用。

按照世界衛(wèi)生組織規(guī)定的化學(xué)物質(zhì)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，連翹苷屬于實(shí)際無毒物質(zhì)[14]。然而，高濃度的連翹苷不僅能使小鼠細(xì)胞染色體發(fā)生突變，同時對精子有致突變作用，故連翹苷的用量還需斟酌。同時，本試驗(yàn)結(jié)果表明，連翹苷未對小鼠肝細(xì)胞DNA 造成損傷，提示連翹苷的遺傳毒性可能是因?yàn)槭瓜嚓P(guān)蛋白質(zhì)產(chǎn)物發(fā)生了改變而產(chǎn)生的，并無損傷遺傳基因的能力，其遺傳毒性產(chǎn)生的機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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