近紅外光譜分析技術(shù)定標(biāo)模型建立及優(yōu)化

高紅秀， 金 萍， 楊 亮， 鄒德堂， 寧海龍

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150030)

近紅外光譜分析技術(shù)具有無(wú)需預(yù)處理、分析速度快、不損壞樣品、能同時(shí)測(cè)定多個(gè)成分、安全無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)[1]，在許多領(lǐng)域特別是在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，已成為糧食品質(zhì)分析的重要手段。近紅外光譜分析技術(shù)中最重要的是定標(biāo)模型的建立，定標(biāo)的合理性決定了近紅外分析準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。模型初建時(shí)標(biāo)樣的選擇、數(shù)量及其設(shè)計(jì)也影響到預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度[2]。本文著重討論了近紅外光譜分析中的定標(biāo)過(guò)程及定標(biāo)的驗(yàn)證與優(yōu)化。

1 定標(biāo)過(guò)程

近紅外光譜分析技術(shù)是一種間接的測(cè)量方法[3]，首先需要選擇一批具有代表性的樣品，用該批樣品建立樣品近紅外光譜與化學(xué)值之間的定標(biāo)模型，然后采集未知樣品的光譜數(shù)據(jù)，與校正模型相對(duì)應(yīng)，計(jì)算出樣品的組分[4]。定標(biāo)過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 近紅外定標(biāo)流程圖

1.1 樣品收集

樣品數(shù)量對(duì)定標(biāo)模型有明顯的影響，樣品數(shù)量不是越多越好，采用合適數(shù)量的樣品進(jìn)行光譜掃描，可以提高模型的預(yù)測(cè)精度[5-6]。樣品應(yīng)具有代表性，樣品范圍要廣，要包含不同季節(jié)、不同區(qū)域、不同品種、不同年份等的樣品[7]。定標(biāo)集樣品應(yīng)盡量覆蓋待分析樣品的變化范圍，分布應(yīng)盡量均勻[8-9]，避免定標(biāo)樣品幾乎一致而造成定標(biāo)模型不具代表性。

1.2 樣品掃描

在做濕化學(xué)分析前，須先對(duì)樣品進(jìn)行掃描。由于現(xiàn)代近紅外光譜分析是通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)多元校正方法，依靠樣品間光譜信息的細(xì)微差別來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析，所以對(duì)儀器的性能指標(biāo)有很高的要求。根據(jù)測(cè)量對(duì)象的不同可選擇透射、漫反射和漫透射方式。對(duì)于育種研究而言，希望能夠在不破壞籽粒的情況下就可以得到分析結(jié)果，以便繼續(xù)種植繁育。

1.3 化學(xué)分析

掃描過(guò)的樣品(同一份樣)要及時(shí)送交實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行濕化學(xué)分析。送交實(shí)驗(yàn)室樣品必需放置于密封的容器中(最好用樣品儲(chǔ)藏罐且罐口需用膠帶密封；封口樣品袋也可接受)，以防止水分和揮發(fā)物的損失。所使用的實(shí)驗(yàn)室分析方法必須是官方認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)方法，對(duì)于濃度極端的樣品，需采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行雙平行或三平行分析。

1.4 確定定標(biāo)樣品集

并不是所有的樣品都能參與定標(biāo)，定標(biāo)集樣品的選擇直接影響所建模型的適用性和準(zhǔn)確性，所以首先要確定哪些樣品是“好”樣品——參與定標(biāo)建模的樣品。“好”樣品是光譜具有總體相似性，并能代表光譜間最大差異的樣品(與其他樣品不重復(fù))。定標(biāo)集樣品的挑選最常用的方法是GN距離法[10]。該方法以全局距離來(lái)界定定標(biāo)集樣品范圍，以鄰域距離來(lái)剔除相似樣品，根據(jù)不同的全局和鄰域距離組合挑選出定標(biāo)集樣品建模。多數(shù)近紅外的化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件在進(jìn)行主成分分析過(guò)程中，都使用馬氏距離計(jì)算GH，但只有FOSS的WINISI軟件有計(jì)算任意2點(diǎn)間NH的功能。

1.5 建立定標(biāo)模型

得到所有的信息(樣品的掃描數(shù)據(jù)和準(zhǔn)確的濕化學(xué)數(shù)據(jù))后，就可以建立數(shù)學(xué)模型來(lái)預(yù)測(cè)未知樣品已建立定標(biāo)成分的值。近紅外光譜定標(biāo)方法主要有MLR(多元線性回歸)；PLS(偏最小二乘法)和ANN(人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))，3種方法比較見(jiàn)表1。天然樣品近紅外定標(biāo)最常用的定標(biāo)技術(shù)為PLS。

表1 3種定標(biāo)模型方法比較

1.5.1 多元線性回歸

此方法主要用于簡(jiǎn)單樣品，若光譜沒(méi)有疊加，則通常借助所分析成分的純品吸收光譜進(jìn)行定標(biāo)波長(zhǎng)的選定，所選定的波長(zhǎng)具有經(jīng)驗(yàn)性和近似性。此法在全譜帶農(nóng)產(chǎn)品近紅外分析中已不使用，目前主要用于濾光片式近紅外定標(biāo)。由于不同農(nóng)產(chǎn)品各成分隨基體組分的變化產(chǎn)生吸收峰漂移，因此濾光片式近紅外在采用MLR對(duì)農(nóng)產(chǎn)品近紅外定標(biāo)時(shí)誤差較大。

1.5.2 偏最小二乘法

采用主成分分析技術(shù)將光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為主成分?jǐn)?shù)據(jù)，然后和化學(xué)分析數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)進(jìn)行定標(biāo)建模，是目前近紅外分析較常使用的方法。對(duì)農(nóng)產(chǎn)品分析而言，PLS永遠(yuǎn)優(yōu)于MLR。處理的數(shù)據(jù)庫(kù)大小有一定限度(幾百個(gè)為宜)，過(guò)大的樣品數(shù)據(jù)庫(kù)存在吸收非線性，分析存在誤差。

1.5.3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

處理大樣品數(shù)據(jù)庫(kù)，模型的適用范圍廣，減少或降低定標(biāo)模型的調(diào)整工作。大數(shù)據(jù)庫(kù)定標(biāo)可以提高定標(biāo)測(cè)試的適用范圍，原定標(biāo)基本不需要調(diào)整；向原定標(biāo)中添加新樣品時(shí)，不影響原定標(biāo)的測(cè)試準(zhǔn)確度。

1.6 定標(biāo)模型的外部檢驗(yàn)

在定標(biāo)方程建立后，應(yīng)采用一組沒(méi)有參與定標(biāo)的獨(dú)立樣品組(即驗(yàn)證樣品集)對(duì)方程的預(yù)測(cè)性能進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證樣品集樣品應(yīng)具有很好的代表性，成分應(yīng)覆蓋一定的范圍，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室參考數(shù)據(jù)必須準(zhǔn)確可靠，以便給出合理的驗(yàn)證結(jié)果。驗(yàn)證樣品集的樣品數(shù)量應(yīng)足夠多以便進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)[11]。當(dāng)樣本總數(shù)一定時(shí)，以70%的樣本建立定標(biāo)模型，其余30%樣本作為驗(yàn)證樣本，可以獲得較好的預(yù)測(cè)效果[4]。

2 定標(biāo)的驗(yàn)證與優(yōu)化

2.1 定標(biāo)的驗(yàn)證

完成定標(biāo)方程后，剛開(kāi)始使用定標(biāo)方程時(shí)要同時(shí)進(jìn)行化學(xué)分析，當(dāng)認(rèn)為定標(biāo)方程性能已經(jīng)可以了，便可以進(jìn)行常規(guī)分析。定期收集每類樣品6～8份，對(duì)所用定標(biāo)模型數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證。如果樣品的驗(yàn)證效果符合要求，則不需要進(jìn)行定標(biāo)的調(diào)整；如果驗(yàn)證效果不符合要求，則從手工分析的準(zhǔn)確性和定標(biāo)模型的適用性等方面找出原因并作相應(yīng)的再驗(yàn)證，直到符合要求定標(biāo)才能使用。

2.2 定標(biāo)的完善

由于自然樣品(分析樣品)的成分隨著種植季節(jié)、施肥、降雨量和種植條件的不斷變化，可以說(shuō)定標(biāo)方程永遠(yuǎn)都處在調(diào)整狀態(tài)。定標(biāo)方程應(yīng)定期采用新樣品的掃描光譜和化學(xué)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)整和升級(jí)，對(duì)模型進(jìn)行升級(jí)將使模型的預(yù)測(cè)性能更穩(wěn)定。利用所得定標(biāo)進(jìn)行日常分析過(guò)程中，可通過(guò)GH和NH繼續(xù)選擇新的樣品填補(bǔ)原有數(shù)據(jù)庫(kù)中的空白點(diǎn)，進(jìn)一步完善定標(biāo)，此操作的目的是使定標(biāo)方程不斷適用待測(cè)樣品的變化。

3 結(jié)束語(yǔ)

定標(biāo)模型的建立一般采用已有的軟件。在需要測(cè)定未知樣品時(shí)，必須使用這一模型及測(cè)定的未知樣品的光譜計(jì)算其組成或性質(zhì)。因此，近紅外光譜分析技術(shù)實(shí)際上是一個(gè)二級(jí)分析方法。它所能得到的準(zhǔn)確度不能超過(guò)在建立模型時(shí)所用測(cè)定組成或性質(zhì)方法的準(zhǔn)確度。同時(shí)，模型的建立需要投入很多的人力、物力和財(cái)力[12]。人們希望能長(zhǎng)期使用已有的模型，這樣就要求測(cè)定吸收譜圖的檢測(cè)手段，即光譜在長(zhǎng)時(shí)期(幾年)內(nèi)是不變的，其中包括譜圖的橫軸(波長(zhǎng))及譜圖的縱軸(吸光度)的長(zhǎng)期穩(wěn)定，—般相對(duì)誤差應(yīng)小于1/1000。為了能使同一模型在不同儀器上使用(即模型共享)，也就是說(shuō)，每臺(tái)儀器間的重現(xiàn)性也要達(dá)到上述要求，當(dāng)然這對(duì)硬件的要求似乎過(guò)分苛刻。近年來(lái)，人們?cè)诹η髢x器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性接近上述要求的同時(shí)，也在軟件方面做了大量工作，稱作模型傳遞技術(shù)。例如，經(jīng)典校正模型傳遞、分段直接傳遞、有限脈沖響應(yīng)(FTR)等，但如何實(shí)現(xiàn)更有效的模型傳遞，則仍是大量推廣近紅外光譜技術(shù)的研究課題之一。

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