SEC-HPLC法測(cè)定重組人生長(zhǎng)激素注射液中苯酚含量

陸春燕， 李增禮， 王榮海,2， 宋禮華,2

(1. 安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司， 合肥 230088； 2. 安徽省生物研究所， 合肥 230088)

重組人生長(zhǎng)激素能夠調(diào)節(jié)代謝、刺激蛋白質(zhì)合成和加速脂肪代謝，其制劑在臨床上主要用于治療兒童因內(nèi)源性生長(zhǎng)激素缺乏或不足而導(dǎo)致的身材矮小癥[1]。重組人生長(zhǎng)激素注射液中通常加入苯酚、苯甲醇或間甲酚作為抑菌、抗氧化輔料。苯酚過(guò)量，對(duì)人體有害，如可抑制中樞神經(jīng)或損傷肝、腎功能等，因此定量檢測(cè)重組人生長(zhǎng)激素注射液中苯酚的含量是質(zhì)控指標(biāo)之一[2-5]。2010版《中國(guó)藥典》[6]和現(xiàn)行歐洲藥典[7]對(duì)苯酚的測(cè)定均采用滴定法，該方法步驟多操作繁瑣；本實(shí)驗(yàn)采用的高效液相色譜法在同一條件下可同時(shí)進(jìn)行重組人生長(zhǎng)激素含量和高分子蛋白質(zhì)的分析，可有效分離苯酚、重組人生長(zhǎng)激素及其高分子蛋白質(zhì)，該方法操作簡(jiǎn)單快捷，無(wú)需額外的檢測(cè)儀器、色譜柱和流動(dòng)相，能極大的節(jié)約分析時(shí)間和分析成本。

1 儀器與材料

島津LC-10AT型液相色譜儀(日本島津公司)，重組人生長(zhǎng)激素注射液為安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司產(chǎn)品(批號(hào)：20100524,20100527,20100601)；苯酚對(duì)照品購(gòu)自Sigma公司(含量>99.5% ，批號(hào)：MKBB0860)；異丙醇為色譜純，購(gòu)自TEDIA公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:TSK G2000SWxL(7.8×300 mm，5 μ)；流動(dòng)相:異丙醇-0.063mol/L PB(pH值7.0)=3：97，；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm；流速:0.6 mL/min；柱 溫:25℃[6]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取苯酚約250 mg置25 mL容量瓶中，用0.025 mol/L(pH值7.0)磷酸鹽緩沖液溶解稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中含10 mg苯酚的溶液，作為對(duì)照品貯備溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別取重組人生長(zhǎng)激素、組氨酸和苯酚對(duì)照品貯備液適量，制成含苯酚3.0 mg/mL的重組人生長(zhǎng)激素溶液，取20 μL，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示重組人生長(zhǎng)激素與組氨酸峰、組氨酸和苯酚之間的分離度分別為7.45和7.05；苯酚峰的理論塔板數(shù)為11240，拖尾因子為1.33；峰面積的RSD=0.27(n=5)。表明該分析系統(tǒng)適應(yīng)性良好。結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖2 重組人生長(zhǎng)激素注射液

2.4 線性

精密量取“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL和10.0 mL，分別置100 mL容量瓶中，用0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解稀釋至刻度，搖勻，按設(shè)定的色譜條件測(cè)定。以苯酚濃度值為橫坐標(biāo)(x)，苯酚峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸?；貧w方程：y=14189427.8236x+1214880.2317，r=0.99915。表明苯酚在0.10～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度

精密量取“2.2”項(xiàng)下苯酚對(duì)照品溶液5.0 mL置于100 mL容量瓶，用0.025mol/L磷酸鹽緩沖液溶解稀釋至刻度，搖勻，同等試驗(yàn)條件下每次進(jìn)樣20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次。經(jīng)計(jì)算，苯酚色譜峰面積RSD=0.27%(n=5)。結(jié)果表明本色譜系統(tǒng)具有較高的精密度。

2.6 重復(fù)性

精密量取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL和10.0 mL分別置于100 mL容量瓶中，用0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，各取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。另取5支(批號(hào)：20100527)同一批次重組人生長(zhǎng)激素注射液，進(jìn)樣檢測(cè)和分析，并按外標(biāo)法計(jì)算苯酚含量。苯酚平均含量為3.01 mg/mL，RSD =0.11%(n=5)。結(jié)果表明系統(tǒng)重復(fù)性良好。

2.7 檢測(cè)限

取“2.2”項(xiàng)下苯酚對(duì)照品溶液適量，制備成濃度分別為0.05 mg/mL、0.005 mg/mL和0.0005 mg/mL溶液，按設(shè)定的色譜條件，各取20 μL注入高效液相色譜儀，直至信噪比S/N=3，此時(shí)樣品濃度即為最低檢測(cè)限。試驗(yàn)結(jié)果表明，在該色譜條件下苯酚最低檢測(cè)限為0.5 ng/mL。

2.8 回收率

配制成苯酚質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL重組人生長(zhǎng)激素溶液。按每份1.0 mL取9份樣品溶液，隨機(jī)分為3組，各組分別準(zhǔn)確加入質(zhì)量濃度分別為0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL苯酚溶液各1 mL，制備成3種濃度的溶液，按設(shè)定的色譜條件，各取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。另取“2.2”項(xiàng)下苯酚對(duì)照品溶液，制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的苯酚溶液作為對(duì)照品溶液，同法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，3個(gè)水平的平均回收率分別為101.71%，100.71%，102.03%，總平均回收率為101.48%(n=9)，RSD=0.58%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確可靠。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

將待檢的3批樣品6倍稀釋制成供試品，取20 μL注入色譜儀，平行進(jìn)樣。另取質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的苯酚對(duì)照品溶液同法測(cè)定，并采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中苯酚的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批重組人生長(zhǎng)激素注射液中的苯酚含量

3 結(jié)論

本試驗(yàn)所采用的色譜條件能有效分離苯酚、組氨酸和重組人生長(zhǎng)激素，不僅能夠檢測(cè)重組人生長(zhǎng)激素中苯酚的含量，而且能同時(shí)測(cè)定樣品中重組人生長(zhǎng)激素的含量。可以極大的節(jié)約重組人生長(zhǎng)激素注射液分析時(shí)間與分析成本。另外，與其他RP-HPLC法測(cè)定苯酚的含量相比[8-14]，本試驗(yàn)采用的流動(dòng)相僅含有少量的有機(jī)溶劑，對(duì)環(huán)境造成的危害更小。綜上所述本方法環(huán)保、準(zhǔn)確、快速、可靠，可用于重組人生長(zhǎng)激素注射液中苯酚含量的測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]Mouin G, Nina S, Bradley W， et al.Use of rhGH in children with chronic kidney disease: lessons from NAPRTCS[J]. Pediatric Nephrology, 2001, 22(8):1195-1204.

[2]Silvia B, Claudia G, Emanuele F, et al. Growth hormone deficiency and recombinant hGH(rhGH) replacement in children with idiopathic isolated GH deficiency: effects on the hypothalamus-pituitary-adrenal axis[J]. Endocrin Abstracts, 2007, 14:P532.

[3]Kenneth R P, William E W, Stephen P M, et al. Stability and preservative effectiveness of treprostinil sodium after dilution in commom intracenous diluents[J].Health-System Pharmacy， 2003， 60(9):916-922.

[4] 楊化新，張培培，徐康森.HPLC法測(cè)定重組人胰島素制劑中苯酚和間苯酚含量[J].藥物分析雜志，2001,21(2):127-128.

[5]王永利，張自萍，李 晶，等.RP-HPLC法測(cè)定重組人生長(zhǎng)激素注射液中間苯酚含量[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009,9(20):3935-3937.

[6]中國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2010[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010,1.

[7]European Pharmacopoeia Commission. EP 8.0 [M]. Strasbourg,European Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare,2013.

[8]潘云志，康 慧，馬 迪，等.反相高效液相色譜法測(cè)定地龍注射液中苯酚含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013, 32(4):532-533.

[9]郭勝才，邢旺興，谷 娜，等.HPLC法測(cè)定無(wú)痛酚中的苯酚含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29(4):372-402.

[10]張 瑾，王 瑾，楊英超，等.高效液相色譜法測(cè)定鉤端螺旋體疫苗中的苯酚含量[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013,26(12):1823-1826.

[11]楊小林，尚慶霞，邱棟樑，等.HPLC法測(cè)定苯酚乳膏中苯酚的含量[J].中國(guó)藥師，2011,14(7):1059-1060.

[12]廖海明，呂海鷗，徐康森.骨肽注射液中苯酚含量的RP-HPLC法測(cè)定[J].藥物分析雜志，2005,25(4):397-398.

[13]尚慶霞，楊小林，邱棟梁.HPLC法測(cè)定薄荷腦苯酚酊中苯酚的含量[J].北方藥學(xué)，2013,10(8):12.

[14]楊 娟，黃敬群，李 紅，等.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方樟腦搽劑中苯酚的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008,28(18):1616-1617.