富含半胱氨酸的分泌蛋白(CRISPs)在哺乳動物授精過程中的作用

丹 彤， 黃文強， 白 雪， 邢萬金

(內蒙古大學生命科學學院 哺乳動物生殖生物學與生物技術教育部重點實驗室, 呼和浩特 010021)

哺乳動物的授精過程由精子成熟、獲能、精卵結合與融合等一系列事件組成，是個復雜而又有序的事件，涉及精子和卵子上的很多特異性蛋白和脂質分子。在眾多與精卵黏附和融合有關的蛋白分子中，研究較多的是精子表面的蛋白，如IZUMO家族中的IZUMO1蛋白、ADAMs(a disintegrin and metalloprotease)家族中的受精素和Cyritestin、PDI(Protein disulfide isomerase)家族中的PDIA3 (ERP57)、CRISPs(cysteine-rich secretory proteins)家族蛋白、SPESP1(Sperm equatorial segment protein 1)、Equatorin、TMEM190 (Transmembrane protein 190)、SPACA (Sperm acrosome associated)家族的SPACA3 (SLLP1)、TSSK6(testis-specific serine/threonine kinase 6)等10多種[1]。其中CRISPs家族蛋白最初發(fā)現于一些嚙齒動物的雄性生殖道組織中，后來在其它哺乳動物、七鰓鰻、非洲爪蟾和毒蛇等脊椎動物中均發(fā)現，是一類在進化上比較保守的分泌蛋白，其成員的氨基酸序列也高度同源。CRISP1、CRISP2均發(fā)現能與卵子表面直接結合，并影響精卵融合，是一類對于哺乳動物生殖極為重要的分泌蛋白。本實驗室近年來克隆并研究了羊、牛CRISP家族成員的cDNA及其與其它精卵融合相關蛋白相互作用，取得了若干原創(chuàng)性發(fā)現。本文將從CRISP家族蛋白的結構與功能組織分布與行為特性，來闡述該家族蛋白在精子成熟、獲能、精卵結合與融合等不同事件上所扮演的重要角色和可能的分子作用機制。

1 CRISPs家族蛋白的結構與功能

CRISPs家族蛋白成員最顯著的特點是富含半胱氨酸，其中有16個半胱氨酸殘基位置高度保守 (圖1)。根據其氨基酸序列同源性和組織分布特性，哺乳動物的CRISPs蛋白可以被分為4個亞類，分別是CRISP1、CRISP2、CRISP3和CRISP4[2-4]，這幾類蛋白均已證明在精子成熟、獲能以及精卵結合與融合過程中具有重要作用[4， 5]。

CRISPs家族蛋白是CAP蛋白超家族(CRISPs,Antigen 5 proteins, Pathogenesis-related proteins)中的一部分，在其蛋白N端具有大約160個氨基酸的高度保守的CAP結構域,是該超家族蛋白共有的結構域，C端有一個富含半胱氨酸的結構域(CRD，cysteine rich domain)，稱為CRISP結構域，是CRISPs家族特有的結構[6-8]。 CAP結構域的結構和氨基酸序列與植物中與病原體侵襲響應機制有關且具有殺菌能力的發(fā)病機制相關蛋白(pathogenesis-related proteins)類似，因而也被稱為PR-1(pathogenesis-related proteins of group 1)結構域。在這個結構域中有6個保守的半胱氨酸殘基，形成3個二硫鍵，對維持CAP結構域獨特的類似α-β-α的折疊結構穩(wěn)定性有重要作用[7， 9]。 在大鼠的CRISP1蛋白的CAP結構域中存在著兩個進化上保守的基序S1(signature 1)與S2(signature 2)。人工氨基酸缺失突變研究表明由12個氨基酸構成的S2基序正是CRISP1蛋白與卵子表面結合的位點[10](圖2)。多數CAP超家族蛋白都在CAP結構域的N端有一段典型的信號肽序列，因此屬分泌蛋白，可能通過諸如離子通道閘門或激活細胞表面受體之類的途徑參與細胞信號傳導調節(jié)，也有可能修飾其它蛋白，參與細胞外基質的重塑或細胞的粘附[9]。從織錦芋螺(Conus textile)毒液管里分離出的CRISP同源蛋白Tex31具有蛋白水解活性[11]，暗示PR-1結構域可是蛋白酶的組成模塊，但是在以后的研究中并沒有發(fā)現其它CRISP蛋白具有酶活性。CRISP蛋白的CRISP結構域由鉸鏈區(qū)(hinge region)和離子通道調節(jié)區(qū)(ICR，ion channel regulatory)組成(圖2)，鉸鏈區(qū)連接著N末端的CAP結構域和C末端的ICR結構域。鉸鏈區(qū)中包含4個保守的半胱氨酸殘基，形成2個二硫鍵，ICR區(qū)有6個保守半胱氨酸殘基，形成3個二硫鍵，如小鼠CRISP1(Uniprot Q03401):C190?C197、C193?C202、C206?C239、C215?C233、C224?C237；CRISP2(Uniprot P16563):C199?C196、C192?C201、C205?C238、C214?C232、C223?C236；CRISP3(Uniprot Q03402):C194?C201、C197?C206、C210?C241、C219?C235、C226?C239；這些交錯的二硫鍵對于該結構域的穩(wěn)定和功能具有重要意義[12， 13]。CRISP結構域內的6個保守性半胱氨酸殘基間的二硫鍵使肽鏈折疊，形成了獨特的具有離子通道調節(jié)活性的溝壑結構[8]，在爬行類和哺乳類中[14]，都具有離子通道調節(jié)活性，例如K+、Ca2+通道抑制性[7， 12]。生殖道中以及精子表面分布的CRISP蛋白也具有離子通道調節(jié)活性，而精子獲能依賴于環(huán)境中的離子濃度[15]，因此推測哺乳動物的CRISP蛋白可能與精子獲能有關。

2 CRISPs家族各成員的結構與功能

2.1 附睪的CRISP1蛋白

CRISP1(DE， AEG)是最早在大鼠附睪中發(fā)現的一種雄性激素劑量依賴性分泌蛋白，附睪頭近端的上皮細胞合成并分泌CRISP1，精子在附睪中儲運時，CRISP1蛋白黏附到精子頭部，定位于大鼠精子頭部背側區(qū)域。

附睪分泌的CRISP1既有全長氨基酸鏈的完整CRISP1，也有一部分被蛋白酶水解加工后形成兩種不同形式的CRISP1蛋白，第一種形式是蛋白D，分子量較大，約32 kDa，它是附睪中CRISP1的最主要的形式，以松散、可逆的方式同精子表面相結合，容易被離子溶液脫去；另一種形式是蛋白E，分子量較小，約22 kDa，同精子表面緊密結合[16]，推測這種形式的CRISP1蛋白可能是C末端的CRISP結構域被剪掉的CRISP1蛋白剪接體[13]。CRISP1在精子上可能有其特殊的受體，當精子離開睪丸進入雌性生殖道后，D形式的CRISP1從精子表面釋放，而E形式的CRISP1仍結合于精子表面，并重新定位，遷移到精子頭部的赤道段區(qū)域[13]。鑒于這個區(qū)域正是精子頭部與卵子膜融合的起始區(qū)域，CRISP1可能還參與精卵融合過程[17]。原核表達的重組大鼠CRISP1能與卵子質膜直接結合[10]，而且與卵結合的活性部位限定在PR-1結構域范圍中的45個氨基酸區(qū)(114-158)，這個區(qū)域包含了兩個CRISP家族的特征基序，分別是S1(signature 1)和S2(signature 2)。實驗結果確定了大鼠CRISP1的S2區(qū)域與卵結合的關聯性[10]。但敲除CRISP1基因的小鼠并不影響生殖，只降低了精子穿過透明帶和與卵融合的能力[18]，可能是CRISP2補充了CRISP1的功能。目前還有待于進行CRISP1和CRISP2雙敲除小鼠實驗，觀察CRISPs對精卵融合的影響。

CRISP2最初被命名為睪丸特異性蛋白1(testis-specific protein 1, Tpx-1)，特異性表達于睪丸及其精細胞上。人和小鼠的CRISP2蛋白是頂體內部的蛋白，在頂體反應后仍然留在精子上[19]。在小鼠配子共孵育時加入CRISP2多克隆抗體，導致精子進入去透明帶卵的穿透率顯著下降，且呈劑量依賴效應[19， 20]。CRISP2抗體也能顯著地降低精子穿透卵子透明帶的穿透率，但最引人注目的是穿過透明帶的精子積聚在卵周隙，說明抗體并未損害精子的能動性和頂體反應，只是抑制精卵融合，即CRISP2在精卵融合階段起作用20。此外，原核表達的重組CRISP2能與去透明帶的人卵子結合[19]。原核表達的重組小鼠CRISP2同CRISP1一樣，在卵的成融區(qū)域具有結合位點，證實了卵表面存在這兩種蛋白的共同結合位點[20]。暗示在同源分子間存在著功能合作或冗余，以確保成功授精。本實驗室近年來發(fā)現羊CRISP2能夠與另一種精卵融合相關蛋白PDIA3相互結合(未發(fā)表)，暗示CRISP2在精子上參與精卵融合復合體的形成。

2.3 組織多樣性的CRISP3蛋白

CRISP3首先在小鼠和人體的唾液腺組織中被發(fā)現。CRISP3在唾液腺中的表達呈現比較強的雄性激素依賴性，在雌性唾液腺中也檢測到微弱的表達[21]。后來發(fā)現CRISP3也表達于小鼠的前B細胞、人的中性白細胞、胸腺、胰腺、淚腺、唾液腺、卵巢、前列腺等組織中[21]，具有組織多樣性。人CRISP3蛋白廣泛存在于外分泌腺體及免疫系統(tǒng)中，暗示CRISP3蛋白可能對病原體入侵等病理應答方面具有免疫保護功能，CRISPs家族蛋白在N末端具有一個與植物致病相關蛋白類似的PR-1結構域，也是對CRISP3可能參與免疫功能的支持。

人附睪中的CRISP3是由附睪上皮分泌細胞合成，在附睪尾腔和輸精管中濃度最高。精液中的CRISP3主要源自附睪下游的附屬生殖組織，如輸精管和前列腺[22]。目前尚無實驗確認CRISP3在生殖過程中的作用，只推測可能與精子成熟有關，或者可能類似CRISP1那樣參與了配子融合時的相互作用[23-25]。

CRISP3 在人的正常前列腺中低水平表達，而在癌性的前列腺中超表達，顯示CRISP3可能與細胞癌變有關。因此可以將CRISP3作為一種檢測前列腺癌的生物標記[25， 26]。但是CRISP3在其它癌組織中并不高表達，例如在慢性胰腺炎組織中雖然比在正常胰腺組織中表達水平高，但在胰腺癌細胞系中沒有檢測到表達，在其它癌性的胃腸道組織中表達也并不高[27]。盡管CRISP3在這些病理組織中的活性機制仍不清楚，但也暗示著CRISP3蛋白在生殖過程之外也扮演重要的角色。

2.4 附睪的CRISP4蛋白

CRISP4目前只發(fā)現于大鼠和小鼠的體內，分布于在附睪的多個區(qū)域，在附睪體和附睪尾的含量最豐富，在這里向成熟的精子上粘附，與精子的成熟有關聯[2， 3， 28， 29]。除了在雄性生殖道中外，在卵母細胞、骨骼肌、脾臟、胸腺中也發(fā)現了低量表達的CRISP4蛋白[3， 30]。大鼠CRISP4和小鼠CRISP4間有91%的相似性，與人類的CRISP1同源，可能與人CRISP1有著功能相似性，作為抑能因子起作用[9]，但目前關于CRISP4的確鑿功能及在CRISP家族中的角色和地位尚沒有充足的研究。

3 展望

自從在哺乳動物中發(fā)現CRISPs分泌蛋白以來，對CRISPs 家族的研究已經取得了長足的進展,積累了很多物種的CRISPs成員的cDNA序列、蛋白結構等基本生物學與功能資料，尤其是它們在生殖過程中的作用。近年來發(fā)現CRISP1和CRISP2都能與卵子直接結合，引發(fā)了人們對其直接參與精卵結合和融合的關注和分離位于卵子表面的潛在結合配體的興趣。 由于CRISPs家族成員在氨基酸序列上的高度同源性和功能的相似性，人們認為它們可能以功能互補形式共同參與精子與卵子結合，這給單獨研究某個成員的作用分子機制帶來了困難。未來的工作仍然需要進一步敲除CRISP基因，包括同時敲除兩個CRISP基因來鑒定他們對應的生殖作用。其次要揭示CRISPs與其它精卵融合相關蛋白之間的相互作用，從而推測它們在影響精卵融合的蛋白復合體或者相互作用鏈中所起的作用。

哺乳動物精卵融合的分子機制是個極為重要的生命科學基礎問題，但由于目前在技術上還不能在體外長期培養(yǎng)并誘導生殖母細胞產生配子，也不能培養(yǎng)哺乳動物的單倍體配子細胞，所以難以解析精子與卵子結合和融合的精細過程以及篩選影響這些關鍵過程的因子。未來的突破方向當務之急是性母細胞培養(yǎng)和誘導分化的技術，其次是改變研究策略，改為研究已知的若干種精卵融合相關蛋白之間的相互作用，找出它們之間的作用方式，推測它們在精卵融合過程中的作用模式。

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