吡咯喹啉醌對大型溞繁殖、發(fā)育、存活和抗饑餓能力的影響

張 鵬， 杜 陽， 孫靜嫻， 邢曉磊

(大連海洋大學 遼寧省水生生物學重點實驗室，大連 116023)

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，簡稱PQQ)，是煙酰胺核苷酸(NAD+和NADP+)和黃素核苷酸(FAD和FMN)之外的第3種有機輔基。自20世紀70年代末其化學結(jié)構(gòu)被確認以來，PQQ的相關(guān)研究已經(jīng)開展了近35年。研究發(fā)現(xiàn)，PQQ既是一種植物生長促進因子[1,2]，也是哺乳動物生長、發(fā)育和繁殖的重要營養(yǎng)物質(zhì)[2-6]。這種由某些細菌產(chǎn)生的小分子醌化合物，以皮摩爾或納摩爾水平，存在于各種植物、動物甚至人體組織內(nèi)[7,8]。目前認為，動物和人體腸道菌群不能合成PQQ或合成量遠遠不能滿足機體需要，其體內(nèi)的PQQ主要是通過外源性飲食途徑獲得。日本學者曾建議將其列為一種新的B族維生素[9]，但這一提法學術(shù)界尚存在爭論[10-12]。迄今為止，PQQ生理功能的研究已經(jīng)在國內(nèi)外廣泛開展，但其對水生生物是否能夠發(fā)揮生理作用，亦或者水生生物能否對PQQ產(chǎn)生生理響應，尚不清楚。本文以國際公認的標準試驗生物大型溞(Daphniamagna)為受試對象，通過外源性添加PQQ，分析其對溞類個體繁殖、壽命和抗饑餓能力的影響，旨在揭示PQQ對水生甲殼類動物的生理作用，為其將來在水生生物學領(lǐng)域的應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

PQQ(純度≥98%)購于上海醫(yī)學生命科學研究中心有限公司，使用時用超純水配制成3 mmol/L的儲備液,用一次性無菌注射器和0.22 μm孔徑的濾膜過濾后，4℃冰箱貯存?zhèn)溆?。試驗用溞由遼寧省水生生物學重點實驗室提供，實驗室內(nèi)用滅菌的自來水培養(yǎng)，以單細胞微藻斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)為食物，連續(xù)孤雌生殖繁殖同步幼溞。

1.2 方法

1.2.1 繁殖、發(fā)育與存活試驗

收集24 h以內(nèi)出生的同步幼溞，隨機分配于12孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1只，孔內(nèi)含有3 mL無菌水，以濃縮的微藻作為食物，投喂密度為4×105個細胞/mL,投喂頻率為每天1次，25℃±1 ℃恒溫培養(yǎng)。試驗設(shè)立3個PQQ處理組，濃度分別為5、15和25 μmol/L，對照組不加PQQ，每組6個平行。每天觀察記錄溞脫殼和產(chǎn)卵情況，當溞開始繁殖后，及時移出新產(chǎn)的幼溞并記錄數(shù)量。每2 d更換1次試驗用液，連續(xù)試驗直至所有溞體全部自然死亡。

1.2.2 饑餓試驗

收集腸道食物已經(jīng)排空的3齡同步溞，隨機分配于100 mL燒杯中內(nèi)，每個燒杯10只，杯內(nèi)含有30 mL無菌水，不投喂任何食物，20℃±1℃恒溫培養(yǎng)。試驗設(shè)立3個PQQ處理組，濃度分別為0.1、0.5和1 mmol/L，對照組不加PQQ，每組3個平行。每天觀察記錄各組溞個體死亡數(shù)量，并移出死亡個體。每天補充蒸發(fā)的水分保持液面體積恒定，連續(xù)試驗直至所有溞體全部死亡。

1.3 統(tǒng)計分析

應用SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，LSD法分析組間顯著性差異，P值小于0.05視為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 PQQ對大型溞繁殖的影響

與對照組相比，不同濃度的PQQ對大型溞的首次懷卵時間、首次產(chǎn)卵時間與首次產(chǎn)幼量均無顯著影響(P>0.05)，PQQ各處理組之間亦無顯著差異(表1)。

由表2可知，5 μmol/L的PQQ能夠顯著提高總產(chǎn)幼量(P<0.05)，15 μmol/L的PQQ則顯著提高了平均每窩產(chǎn)幼量(P<0.05)。組間差異性分析表明，15 μmol/L PQQ處理組的總窩數(shù)顯著低于5 μmol/L PQQ處理組(P<0.05)，25 μmol/L PQQ處理組的總窩數(shù)和總產(chǎn)幼量均顯著低于5 μmol/L PQQ處理組(P<0.05)。

表1 不同濃度PQQ處理下大型溞的首次繁殖參數(shù)

表2 不同濃度PQQ處理下大型溞的總體繁殖能力

不同小寫字母表示各處理組與對照組差異顯著，不同大寫字母表示各處理組之間差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 PQQ對大型溞發(fā)育與存活的影響

由表3可知，不同濃度的PQQ對大型溞發(fā)育過程中的幼齡數(shù)、成齡數(shù)、總齡數(shù)以及存活時間均無顯著影響(P>0.05)。組間差異性分析表明，15和25 μmol/L PQQ處理組的成齡數(shù)、總齡數(shù)和存活時間均顯著低于5 μmol/L PQQ處理組(P<0.05)，而3組間的幼齡數(shù)則無顯著變化(P>0.05)。

表3 不同濃度PQQ處理下大型溞的齡期和存活時間

2.3 PQQ對大型溞抗饑餓能力的影響

表4 饑餓條件下PQQ對大型溞抗饑餓能力的影響

由表4可知，饑餓條件下，不同濃度的PQQ對大型溞的初始死亡時間無顯著影響(P>0.05)，但日均死亡數(shù)均顯著降低(P<0.05)，而0.1 和0.5 mmol/L PQQ處理組的最長存活時間和半數(shù)死亡時間LT50均顯著高于對照組(P<0.05)。組間差異性分析表明，0.1 和1.0 mmol/L PQQ處理組的最長存活時間顯著低于0.5 mmol/L PQQ處理組(P<0.05)，兩者的日均死亡數(shù)則顯著高于0.5 mmol/L PQQ處理組(P<0.05)。3組間的LT50值均有顯著差異(P<0.05)。

由圖1的存活曲線可以看出，對照組溞在饑餓后第2天大量死亡，僅有2只個體存活，而0.1 和0.5 mmol/L PQQ處理組溞的存活個體數(shù)分別為8.33只和9只。饑餓后第3天對照組溞全部死亡，而3個PQQ處理組的溞個體仍有存活，其中以0.5 mmol/L PQQ處理組的存活數(shù)達到了5.33只。隨著時間的延長，0.5 mmol/L PQQ處理組溞的存活數(shù)緩慢下降，顯示出了較好的抗饑餓效應。

圖1 饑餓條件下大型溞的存活曲線

3 討論

3.1 PQQ對大型溞繁殖、發(fā)育與存活的影響

研究表明，飲食中缺乏PQQ會導致試驗小鼠和大鼠出現(xiàn)一系列的不良反應，包括新生幼鼠生長發(fā)育受損，免疫功能缺陷和母鼠繁殖能力下降等[2-6]。近年報道顯示，飲食中添加PQQ能夠促進母雞產(chǎn)蛋率和提高蛋質(zhì)量，同時增強母雞的抗氧化應激能力[13]。本研究表明，PQQ能夠增強大型溞的繁殖能力，以5 μmol/L濃度效果最好，表現(xiàn)為總產(chǎn)幼量顯著增加。這與哺乳動物和禽類的研究結(jié)果相類似。PQQ對大型溞的首次懷卵時間、首次產(chǎn)卵時間與首次產(chǎn)幼量均無顯著影響，這說明其促繁殖作用主要發(fā)揮于繁殖中后期。以前的研究證明，PQQ既是一種強抗氧化劑，也是一種強促氧化劑，因此被認為是“雙面”分子[14]。PQQ的最終效應取決于其作用濃度和所處的微環(huán)境[15,16]。本研究顯示，PQQ濃度增加到15 和25 μmol/L會導致其促繁殖效應的下降，主要反映在總產(chǎn)幼量和總窩數(shù)的減少，因此推測PQQ濃度過高可能會對動物的繁育起到負面作用。PQQ對大型溞的齡數(shù)和存活時間無顯著影響，但值得注意的是，與5 μmol/L濃度組相比，15 和25 μmol/L的PQQ顯著降低了大型的齡數(shù)和存活時間，這種濃度依賴效應與繁殖試驗所得到的結(jié)果類似，提示高濃度的PQQ很可能還會顯著影響動物的發(fā)育過程，降低動物的存活時間(壽命)。

3.2 PQQ對大型溞抗饑餓能力的影響

由于自然界中環(huán)境的變遷、季節(jié)更替以及食物在時空上的不均勻分布性，動物在其生命周期中經(jīng)常面臨食物資源的短缺而受到饑餓脅迫。甲殼類是水生動物中的一個主要類群，其饑餓生理的研究由來已久[17,18]。線粒體是細胞的能量工廠，同時也是內(nèi)源性氧自由基產(chǎn)生的主要細胞器。全饑餓條件下，機體的外界能源物質(zhì)供給中斷，線粒體內(nèi)的能量代謝方式發(fā)生轉(zhuǎn)變，氧自由基過度產(chǎn)生，機體內(nèi)環(huán)境平衡被打破，這是導致動物機體死亡的主因。本研究表明，PQQ能夠保護大型溞免受饑餓脅迫損傷，表現(xiàn)為饑餓溞體的存活時間明顯延長，LT50值升高以及日平均死亡個體數(shù)的降低。其中，以0.5 mmol/L濃度的PQQ 作用效果最為明顯。PQQ與線粒體之間的關(guān)系已經(jīng)有過很多研究，并已成為PQQ生物學功能機理研究的熱點之一。PQQ能夠保護線粒體免受氧化損傷，調(diào)節(jié)線粒體的質(zhì)量和功能，逆轉(zhuǎn)線粒體復合體Ⅰ抑制劑二亞苯基碘DPI的抑制作用等等[6,19-21]。線粒體的生物發(fā)生是由過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)和核呼吸因子(NRF)等轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)節(jié)。PQQ能夠激活PGC-1α啟動子，增加其mRNA和蛋白表達，并增強PGC-1α通路中NRF1、NRF2、Tfam、TFB1M、TFB2M等其他轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達，從而增加線粒體發(fā)生和氧化代謝水平[21,22]。因此，我們推測PQQ的抗饑餓應激效應與其調(diào)節(jié)線粒體功能密切相關(guān)。

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