敵百蟲對中國林蛙蝌蚪生長發(fā)育的毒性效應

馬 瑜，李 勃，張育輝

1. 陜西師范大學生命科學學院 秦巴山區(qū)可持續(xù)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，西安 710062 2. 陜西省微生物研究所，西安 710043

近年來，兩棲動物種群數(shù)量不斷下降，其原因之一是由于殺蟲劑、除草劑等化學農(nóng)藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的濫用導致土壤、地下及地表水源的持續(xù)污染[1-2]，進而對整個水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響[3-4]，嚴重威脅兩棲類的生存。有機磷農(nóng)藥是繼有機氯農(nóng)藥被禁止使用后目前應用最為廣泛的一類殺蟲劑，它們可直接殺死兩棲動物，也可通過影響其生殖行為、降低孵化率及引起免疫抑制而間接影響兩棲類種群數(shù)量[5]。

敵百蟲(trichlorfon)，化學名O,O-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯，是我國目前應用較為廣泛的一種有機磷殺蟲劑，由于其廣譜、高效、低毒等特點而被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)、種植業(yè)及加工業(yè)之中[6]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，0.1～1.0 mg·L-1敵百蟲通常用于防治水生昆蟲對養(yǎng)殖對象的疾病感染和蠕蟲的體外寄生，同時也可用于控制水體中的浮游生物[7-9]。但長期反復使用敵百蟲，將導致殺蟲劑殘留在水體及淤泥中富集，造成水域化學污染，對魚、蟹、蝦類等非靶標生物中的有益生物產(chǎn)生直接毒性[10-12]。

有關敵百蟲對魚、蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的急性和慢性毒理學研究目前已有報道[13-15]，但有關水域中有機磷殺蟲劑對兩棲動物幼體的生長發(fā)育影響的相關研究仍較少。兩棲動物的胚胎及幼體發(fā)育過程均在水域中進行，其皮膚對水體中的離子等化學物質具有較高的滲透性，因而水體中有毒物質很容易影響胚胎及幼體的發(fā)育[16]。因此，兩棲動物可作為檢測水域化學污染效力的理想材料之一，其生態(tài)分布也可作為環(huán)境污染程度的指示種群[17]。

中國林蛙(Ranachensinensis)是廣泛分布于中國北方各地的重要經(jīng)濟動物，近年來受棲息地水源生態(tài)環(huán)境污染的脅迫，野生種群數(shù)量急劇下降。本研究以野生中國林蛙蝌蚪為研究對象，通過急性毒性試驗，獲得敵百蟲對中國林蛙蝌蚪的毒性指標。然后，將蝌蚪長時間暴露于安全濃度(SC)以下或略高于SC的低濃度敵百蟲水體中，觀察敵百蟲對蝌蚪生長發(fā)育的影響，探討水體中以敵百蟲為代表的新型低毒類有機磷農(nóng)藥污染對兩棲動物生長發(fā)育的毒性，為進一步深入研究其毒理機制提供資料，同時也為兩棲動物生殖環(huán)境的保護、水生生態(tài)風險評價以及水域污染的治理提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材 料

中國林蛙(Ranachensinensis)受精卵采集于2013年3月陜西省西安市大峪水庫附近，實驗室孵化，孵化水溫20±2 ℃，pH 6.8～7.0，鹽度1.8～1.9 g·L-1。待蝌蚪發(fā)育至Gosner 28～29期[18]，選用大小一致的蝌蚪進行水體暴露實驗。敵百蟲(90%晶體，湖北沙隆達公司)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 急性毒性試驗

通過預實驗，設10、15、20、25、30 mg·L-1敵百蟲共5個濃度組，設1個空白對照組。處理和對照均設2個平行組，每組20只蝌蚪，每個處理濃度共40例。采用靜水連續(xù)暴露，實驗的前8 h連續(xù)觀察，隨后在12、24、48、72和96 h觀察并記錄蝌蚪的中毒癥狀和死亡數(shù)，并及時清理死亡蝌蚪。實驗用水為曝氣2 d以上的自來水，24 h更換1次，急性毒性實驗期間禁食。

1.3 慢性毒性試驗

在急性毒性試驗的基礎上，在零致死濃度(LC0)以下設0.2、0.5、1.0和2.0 mg·L-1敵百蟲共4個暴露濃度，設1個空白對照組。處理和對照均設兩個平行組，每組20只蝌蚪，每個處理濃度共40例。暴露水溫20±3 ℃，每48 h換1次水并重新加藥，加藥4 h后投食，飼喂蛋黃、新鮮蔬菜和豬肝。實驗前受試蝌蚪為28～29期，體重0.0856±0.0057 g，體長(從吻端至泄殖腔)7.012±0.14 mm。每天觀察并記錄蝌蚪的死亡和畸形數(shù)。分別在暴露28和42 d時，測量體重及體長，最后統(tǒng)計從暴露開始到75%的個體完全變態(tài)所用的時間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

急性毒性實驗數(shù)據(jù)用線性回歸法處理，計算敵百蟲分別在24、48、72和96 h對蝌蚪的零致死濃度(LC0)、半致死濃度(LC50)和全致死濃度(LC100)，安全濃度(SC)采用公式：SC=96 h LC50×0.1計算。慢性毒性實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件處理，用單因子方差分析(one-way ANOVA)檢測不同濃度組蝌蚪的體重、體長及變態(tài)時間的差異顯著性。數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤差表示。p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。

2 結果(Results)

2.1 敵百蟲對中國林蛙蝌蚪的急性毒性

2.1.1 蝌蚪的中毒癥狀

中國林蛙蝌蚪被暴露于含敵百蟲的水體中后，立即表現(xiàn)出騷動不安，不斷浮出水面，游速加快。在25和30 mg·L-1組，蝌蚪暴露6 h后開始出現(xiàn)中毒癥狀，臥于水底或側仰游動，對玻棒觸之的刺激反應遲緩，僅原地游動。在10、15、20 mg·L-1組，蝌蚪暴露12 h后出現(xiàn)中毒癥狀。暴露24 h，部分蝌蚪游動中平衡失調，有的尾部彎曲與身體呈一定角度。隨著暴露時間的延長對外來刺激的反應愈發(fā)遲緩，似喪失知覺。在30 mg·L-1組，暴露24 h后出現(xiàn)蝌蚪死亡，在25、20和15 mg·L-1組，暴露48 h出現(xiàn)死亡，在10 mg·L-1組，72 h出現(xiàn)死亡。蝌蚪死亡后尾部多呈彎曲狀，仰翻，外觀浮腫、膨大。蝌蚪死亡后2 h內解剖觀察，其鰓腔內充水，內鰓萎縮，肝臟、腸管和腎臟呈灰白色。

2.1.2 蝌蚪的死亡率

統(tǒng)計分析不同濃度敵百蟲水體與蝌蚪死亡率的關系，在相同暴露時間，蝌蚪的死亡率隨著敵百蟲濃度的增加和處理時間的延長而升高(圖1)。蝌蚪暴露在含敵百蟲的水體中的死亡數(shù)和死亡率，用線性回歸法計算敵百蟲在24、48、72及96 h對中國林蛙蝌蚪的零致死濃度(LC0)、半致死濃度(LC50)、全致死濃度(LC100)及安全濃度(SC)，并通過回歸分析得出中國林蛙蝌蚪死亡幾率與敵百蟲濃度的回歸方程(表1)。

2.2 敵百蟲對中國林蛙蝌蚪生長的影響

在慢性毒性試驗中，蝌蚪在不同濃度敵百蟲水體和對照組中暴露21 d和42 d，對其體重、體長及全長進行測量并統(tǒng)計處理。結果顯示(圖2)，暴露21 d，與對照組相比，1.0、2.0 mg·L-1組蝌蚪的體重增長較慢(p<0.05)，其余處理組與對照組無顯著差異(p>0.05)。在暴露42 d，與對照組相比，各敵百蟲處理組蝌蚪體重增加均受到抑制，其中，0.2、0.5 mg·L-1組效應顯著(p<0.05)，1.0、2.0 mg·L-1組蝌蚪效應極顯著(p<0.01)。

圖1 敵百蟲濃度與中國林蛙蝌蚪死亡率的關系Fig. 1 Relationship between trichlorfon concentration and death ratio of tadpoles Rana chensinensis

表1 中國林蛙蝌蚪暴露于敵百蟲中死亡幾率與敵百蟲濃度的回歸分析Table 1 Regress equation between death probability of tadpoles Rana chensinensis and trichlorfon concentration

注：y，死亡率幾率值；x，敵百蟲濃度；b，回歸系數(shù)；a，截距。 Note:y, death probability value;x, trichlorfon concentration; b, regression coefficient; a, intercept.

蝌蚪體長統(tǒng)計結果與體重統(tǒng)計結果相似(圖3)，在暴露21 d，與對照組相比，1.0、2.0 mg·L-1組中國林蛙蝌蚪的體長增加較慢(p<0.05)，其余處理組與對照組無顯著差異(p>0.05)。暴露42 d，與對照組相比，各敵百蟲處理組蝌蚪的體長增加均受到抑制，0.2、1.0 mg·L-1組效應顯著(p<0.05)，1.0、2.0mg·L-1組效應極顯著(p<0.01)。

比較蝌蚪暴露于不同濃度敵百蟲后的體重和體長的變化，其規(guī)律趨于一致?？梢姅嘲傧x對蝌蚪生長的抑制效應在一定濃度范圍呈劑量效應，隨著暴露時間的延長，抑制效應逐漸顯著，呈現(xiàn)時間累積效應規(guī)律。

2.3 敵百蟲對中國林蛙蝌蚪發(fā)育的影響

在慢性毒性試驗中，統(tǒng)計不同濃度敵百蟲處理組蝌蚪從開始暴露的28～29期到75%個體完全變態(tài)所需時間、死亡率及致畸率。結果顯示，2.0 mg·L-1組蝌蚪一直未達到75%個體完全變態(tài)，其它各敵百蟲處理組與對照組相比，75%個體完全變態(tài)時間有不同時間的滯后(表2)。各敵百蟲處理組中蝌蚪的死亡率和畸形率均高于對照組(表2)?；沃饕憩F(xiàn)為尾巴彎曲，腹部膨大呈透明狀，其內臟清晰可辨，個別個體后肢肥大或前肢缺失(圖4)。

圖2 中國林蛙蝌蚪暴露于不同濃度敵百蟲中體重的變化注：與對照比較，*p<0.05，**p<0.01。下同。Fig. 2 Weight of tadpoles Rana chensinensis exposed to different concentrations of trichlorfonNote: *p<0.05，**p<0.01, compared with the control. Similarly hereinafter.

圖3 中國林蛙蝌蚪暴露于不同濃度敵百蟲中體長的變化Fig. 3 Length of tadpoles Rana chensinensis exposed to different concentrations of trichlorfon

表2 中國林蛙蝌蚪暴露于不同濃度敵百蟲后的變態(tài)時間、死亡率和畸形率Table 2 Death, abnormality ratio and metamorphosis time of tadpoles Rana chensinensis exposed to trichlorfon

注：-未完全變態(tài)。

Note:-has not been metamorphosis.

圖4 中國林蛙蝌蚪暴露于敵百蟲發(fā)生的畸形注：A，正常中國林蛙蝌蚪；B，尾部彎曲；C，腹部水腫；D，臟器呈灰白色；E，胸部膨大透明；F，變態(tài)后正常幼蛙；G，后肢肥大且前肢缺失。標尺=5 mm。Fig. 4 Abnormality of tadpoles Rana chensinensis exposed to trichlorfonNote: A, normal tadpoles R. chensinensis; B, tail bent; C, abdominal swelling; D, organs off-white; E, chest swelled and transparent; F, normal froglets Rana chensinensis; G, hindlegs hypertrophy and foreleg missing. Bar=5 mm.

3 討論(Discussion)

3.1 敵百蟲對中國林蛙蝌蚪的急性毒性

作為有機磷酸酯類殺蟲劑，敵百蟲的主要致毒作用是經(jīng)機體吸收后與骨骼肌突觸及肌肉神經(jīng)接點的膽堿酯酶結合，形成不易水解的磷?；憠A酯酶，從而抑制膽堿酯酶的活性，導致乙酰膽堿在突觸內蓄積，致使神經(jīng)突觸傳導中斷，引起生物神經(jīng)功能紊亂，誘發(fā)中毒癥狀，被廣泛用于農(nóng)作物保護和害蟲防治、生物體內外寄生蟲的殺滅，也被用于治療阿爾茨海默癥[12,13,19,20]。除了引起抗膽堿酯酶作用，敵百蟲對機體的毒性還包括對抗氧化防御體系造成影響，改變機體抗氧化激酶的活性，誘發(fā)體內、外的氧化應激反應[21-22]。

在本實驗，中國林蛙蝌蚪的死亡率隨著水體中敵百蟲的濃度增加及暴露時間的延長而增高。中毒瀕死的蝌蚪均呈現(xiàn)側翻游動、并頻繁出現(xiàn)肌肉抽搐等典型的神經(jīng)中毒癥狀。死亡后尾部多呈強直性彎曲狀，仰翻，外觀浮腫、膨大。通過解剖觀察，多數(shù)中毒致死的蝌蚪鰓腔內充水，內鰓萎縮，其肝臟、腎臟及腸管發(fā)生病變呈灰白色，說明除典型的神經(jīng)毒性作用外，敵百蟲還可能引起蝌蚪內臟的氧化損傷。統(tǒng)計結果顯示，中國林蛙蝌蚪在含敵百蟲的水體暴露24、48、72、96 h后的LC50分別為142.50±3.23、49.19±1.28、25.68±2.04和15.55±1.933 mg·L-1，其變化范圍較大，表明敵百蟲可在蝌蚪體內聚集，對機體產(chǎn)生直接毒性損傷，使得LC50在短時間內大幅度降低。其SC為1.56±0.19 mg·L-1，可見敵百蟲對蝌蚪有較強的急性毒性。

近年來，由于對農(nóng)藥殘留污染問題的日益重視，對于像敵敵畏、甲胺磷、三唑磷等對人及哺乳動物具有較強毒性的有機磷殺蟲劑正在逐步被禁用，而對較低毒性的敵百蟲則使用愈發(fā)廣泛。與此同時，敵百蟲對于非靶標生物的安全性問題也正在受到關注[23]。據(jù)報道，用含極低劑量敵百蟲殘留的飼料飼養(yǎng)草魚，雖然不影響其進食量和存活率，但會引起草魚生理反應的改變，如乙酰膽堿酯酶活性降低，引起肝組織結構發(fā)生改變，而且對疾病的易感性增加[23]。研究已表明，敵百蟲對于水生生物的毒性具有較大差異。例如，對斑馬魚幼體和成體而言，其96 h的LC50分別為25.4和28.8 mg·L-1[24]，另一報道敵百蟲對斑馬魚和鯽魚96 h的LC50值為52.50、58.29 mg·L-1[25]，而對于沼澤綠牛蛙(Ranagrylio)蝌蚪的96 h LC50值為7.94 mg·L-1[26]，本實驗中測定敵百蟲對中國林蛙蝌蚪的96 h LC50值為15.5 mg·L-1。盡管由于不同物種的生物學特性、原生活環(huán)境以及所處發(fā)育階段的不同，可能導致有關實驗數(shù)據(jù)具有一定的差異，但對于發(fā)育中的兩棲類幼體，敵百蟲的毒性仍是顯著的。所以，所謂敵百蟲的“低毒”只能是對人或大型的哺乳動物而言。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖以及田間施藥中所使用的建議劑量將無疑對兩棲動物的繁殖和生存造成嚴重威脅。因此對于敵百蟲及其類似低毒類的有機磷殺蟲劑對非靶標水生生物毒性的深入研究，對完善農(nóng)藥對水體及水源涵養(yǎng)地生態(tài)安全的風險評估顯得尤為重要。

3.2 敵百蟲對中國林蛙蝌蚪生長發(fā)育的影響

低劑量有機磷農(nóng)藥對于水生動物生長發(fā)育的毒理機制研究已有報道。如在羅非魚(Oreochromisniloticus)，0.25 ppm敵百蟲暴露72 h即可引起鰓的水腫和充血，直接影響魚體重的增長[11]。敵百蟲可抑制魚類胚胎和幼體的正常發(fā)育過程，導致發(fā)育畸形，甚至死亡。不同濃度敵百蟲水體可降低斑馬魚胚胎的色素沉積，并影響孵化率和卵黃蛋白原吸收率，其效應呈現(xiàn)劑量和時間的依賴性。高劑量的敵百蟲(160 mg·L-1)暴露2 d可引起89.6%的胚胎死亡，而較低劑量(20 mg·L-1)敵百蟲暴露3 d則引起幼體心包產(chǎn)生水腫，并且氧化應激過程中關鍵代謝酶活性發(fā)生變化，誘發(fā)體內產(chǎn)生大量活性氧，這可能是敵百蟲對機體產(chǎn)生毒性的機制之一[24-25]。在本實驗，蝌蚪在SC以下的敵百蟲水體中連續(xù)暴露，對其生長發(fā)育仍具有不同程度的抑制作用，說明敵百蟲在SC以下的低劑量持續(xù)暴露也會對蝌蚪生存構成脅迫。在濃度為0.2 mg·L-1，體重和體長的增長也受到不同程度抑制。在濃度大于1.0 mg·L-1暴露21 d，蝌蚪的體長和體重增長均被顯著抑制。在暴露42 d時，所有處理組蝌蚪的生長均受到不同程度的抑制?？梢娫赟C以下的敵百蟲對于蝌蚪生長的抑制隨暴露時間的延長呈累積效應，與已有研究結果所得結論一致。

在慢性實驗過程中，隨著敵百蟲劑量的增加，蝌蚪的死亡率升高。在濃度1.0 mg·L-1組在75%個體變態(tài)后，死亡率已達56%，在濃度略高于SC 的2.0 mg·L-1組，其死亡率達到78%。統(tǒng)計蝌蚪完成變態(tài)所需時間，經(jīng)敵百蟲處理后，各組蝌蚪變態(tài)所用的時間均滯后，而且 2.0 mg·L-1組未達到75%的個體變態(tài)就大部分死亡。觀察可見，在SC以下的敵百蟲水體中，在蝌蚪發(fā)育的各個期，敵百蟲均可導致蝌蚪產(chǎn)生畸型，表現(xiàn)為身體扭曲、尾部強直性彎曲、腹部膨大、肢體缺失或畸形等。在略高于SC的2.0 mg·L-1水體中，這一現(xiàn)象更為嚴重。其原因可能是蝌蚪體壁結構較為簡單，水體中敵百蟲容易滲透作用進入神經(jīng)系統(tǒng)并累積，通過抑制膽堿酯酶活性，導致乙酰膽堿蓄積，從而發(fā)生肌肉強直收縮，由于肌肉強直收縮導致身體扭曲或彎曲，蝌蚪無法自由游動及攝食，最終死亡。其實質應為神經(jīng)性中毒[27]。

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