DKK－1與腫瘤的研究進(jìn)展

黃曉紅（綜述），游金輝（審校）

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，南充 637000）

1 DKK基因

DKK（Dickkopf）是一組分泌型糖蛋白，Wnt通路抑制因子，其包含 DKK－1、DKK－2、DKK－3、DKK－4和 DKKL－1（Dickkopf－like protein 1，Soggy），它們由225～350個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)組成，DKK－1、DKK－2、DKK－4相對(duì)分子質(zhì)量約25～29k，DKK－3相對(duì)分子質(zhì)量約38k。DKKs由2個(gè)富含半胱氨酸的保守區(qū)域及與之連接的不等長區(qū)域構(gòu)成，每個(gè)富含半胱氨酸區(qū)域包含10個(gè)半胱氨酸殘區(qū)。每個(gè)富含半胱氨酸區(qū)域的氨基末端（the amino－terminal cysteine－rich domain，Cys－1）對(duì)應(yīng)不同的 DKK 基因，且每個(gè)富含半胱氨酸區(qū)域的羧基末端（the carboxyl－terminal cysteine－rich domain，Cys－2）是DKK家族成員中最保守的區(qū)域。所有的DKK基因都擁有數(shù)個(gè)可被蛋白酶水解的位點(diǎn)，可能與翻譯后修飾有關(guān)。DKK是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的抑制因子，分泌蛋白Wnt與表面受體Frizzled結(jié)合，通過β－catenin（連環(huán)蛋白）的降解復(fù)合體阻斷β－catenin的降解途徑，促使β－catenin進(jìn)入細(xì)胞核與T細(xì)胞集合，從而啟動(dòng)多種靶基因表達(dá)。此外，Wnt發(fā)生作用還需要低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白－LRP5／LRP6的參與，而DKK－1能夠與LRP5／LRP6、Kremen1／2形成三聚體，通過誘導(dǎo)快速的細(xì)胞內(nèi)吞功能，減少細(xì)胞膜上的LRP5／LRP6，從而阻斷 Wnt信號(hào)向胞內(nèi)傳遞。Ellwanger等［1］研究顯示，Krem1和 Krem2對(duì)DKK－1相關(guān)功能的發(fā)揮不是普遍存在的，即DKK－1可不連接 Krem1和Krem2而發(fā)揮拮抗Wnt信號(hào)通路的活性。

DKK－1是DKK家族中研究最多的基因。人DKK－1基因由266個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)組成，相對(duì)分子質(zhì)量約29k，糖基化形式的DKK－1分子質(zhì)量約35k。DKK－1拮抗 Wnt信號(hào)通路有2種機(jī)制［4］：一種是 DKK－1連接到 Wnt共受體－LRP5／LRP6和卷曲蛋白Kremen1和Kremen2，形成一個(gè)三元復(fù)合物，從而引起內(nèi)吞，并將LRP5／LRP6移出漿膜，導(dǎo)致LRP5／LRP6將不能與Wnt配體和跨膜受體結(jié)合，阻止信號(hào)受體復(fù)合物的形成，最終抑制細(xì)胞外Wnt信號(hào)的活化。另一種是DKK－1與LRP6連接并隔離它，Wnt引導(dǎo)的卷曲蛋白LRP6復(fù)合體形成受阻。

2 DKK－1與腫瘤的關(guān)系

在許多腫瘤中 Wnt通路過度活化，DKK－1作為經(jīng)典Wnt通路抑制物也受到重視，對(duì)其研究日益增多。研究［2］顯示：DKK－1具有復(fù)雜的功能，在不同腫瘤中的作用亦有差異。Liu等［3］對(duì)11篇（原發(fā)性肝癌4篇，卵巢癌、食管癌和肺癌各2篇，多種腫瘤1篇）關(guān)于DKK－1高表達(dá)的實(shí)體腫瘤的meta分析發(fā)現(xiàn)，DKK－1水平越高，患者總生存期及無病生存期就越短。DKK－1有可能作為亞洲人實(shí)體腫瘤患者的預(yù)后指標(biāo)。

2.1 DKK－1與肝癌及膽管細(xì)胞癌

研究報(bào)道DKK－1在肝細(xì)胞癌細(xì)胞株及組織中高表達(dá)。Yu等［4］首次報(bào)道了肝細(xì)胞癌的DKK－1的高表達(dá)與胞漿／胞核中β－catenin聚集有關(guān)。一項(xiàng)納入831例的大樣本研究［5］分析顯示，肝細(xì)胞癌患者血清DKK－1明顯高于其他對(duì)照組（慢性乙肝病毒感染、肝硬化、健康對(duì)照），血清DKK－1濃度的高低，可以將肝細(xì)胞癌從乙肝病毒感染者、肝硬化患者和健康人中區(qū)分出來。DKK－1結(jié)合AFP診斷肝細(xì)胞癌的準(zhǔn)確性明顯高于任一項(xiàng)單獨(dú)診斷，由此推測(cè)，DKK－1能補(bǔ)充AFP診斷肝細(xì)胞癌的不足。Tung等［6］對(duì)該831例大樣本研究進(jìn)行了詳細(xì)分析，也贊同DKK－1對(duì)肝癌診斷具有重要的作用。

生存分析［7］表明，肝細(xì)胞癌的 DKK－1表達(dá)越高，其預(yù)后越差。此外，DKK－1被證實(shí)為肝細(xì)胞癌患者總生存期及無病生存期的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。肝細(xì)胞癌患者5年總生存期和無病生存率高的患者其DKK－1表達(dá)（43.4%和34.2%）明顯低于5年總生存期和無病生存率低的患者的DKK－1表達(dá)水平（59.3%和55.2%）。盡管AFP升高仍然是肝細(xì)胞癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是一部分肝細(xì)胞癌患者AFP在正常范圍，對(duì)AFP正常的肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行分組，DKK－1水平越高其預(yù)后越差，表明DKK－1可作為AFP正常的肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后指標(biāo)。同時(shí)，肝細(xì)胞癌患者DKK－1和β－catenin水平高者預(yù)后也差。不表達(dá)DKK－1和β－catenin的肝細(xì)胞癌患者的5年生存期和無病生存率分別為66.0%和59.8%，而DKK－1和β－catenin高表達(dá)患者則分別為46.0%和18.0%［8］。上述研究表明，DKK－1在肝細(xì)胞癌患者Wnt／β－catenin信號(hào)通路中起到了非常重要的作用。

DKK－1在肝細(xì)胞癌組織及血清中均高表達(dá)，同時(shí)還有作為肝細(xì)胞癌患者預(yù)后指標(biāo)的潛力。DKK－1與肝細(xì)胞癌侵襲力方面的研究也有報(bào)道，Tao等［9］對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲力研究發(fā)現(xiàn)：DKK－1在肝癌細(xì)胞組織，尤其是有血管浸潤的組織中表達(dá)顯著增加。此外，DKK－1高表達(dá)與多個(gè)淋巴結(jié)及靜脈浸潤有關(guān)。研究還表明，DKK－1在體內(nèi)和體外均可以提高肝癌細(xì)胞的侵襲力和轉(zhuǎn)移力；DKK－1提高侵襲力和非侵襲力是通過非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路完成的。

DKK－1在膽管細(xì)胞癌中也有研究報(bào)道，Shi等［10］檢測(cè)了膽管細(xì)胞癌組織（133例）及血清（37例）中的DKK－1水平，發(fā)現(xiàn)患者的DKK－1水平與總生存期及復(fù)發(fā)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)；膽管細(xì)胞癌組織中高水平的DKK－1與肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，DKK－1越低，癌細(xì)胞遷移及侵襲力越弱。由此推測(cè)，DKK－1是判斷膽管細(xì)胞癌預(yù)后的新指標(biāo)，它能提高腫瘤細(xì)胞的侵襲力，促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，DKK－1有可能作為膽管細(xì)胞癌治療的新靶點(diǎn)。

2.2 DKK－1與肺癌

閆紅紅［11］通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建DKK－1的真核細(xì)胞表達(dá)載體，并篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DKK－1表達(dá)載體的肺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的人肺癌細(xì)胞株95－C遷移及侵襲能力明顯增強(qiáng)，該結(jié)果提示：DKK－1可能與肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

Chu等［12］對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者存在骨轉(zhuǎn)移及無骨轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，后者血清DKK－1水平明顯高于前者，肺癌細(xì)胞源性DKK－1能有效抑制成骨細(xì)胞的分化、決定堿性磷酸酶的活性和骨鈣素的分泌，結(jié)果表明，DKK基因在肺癌患者血清及腫瘤組織中都有表達(dá)，且存在某種相關(guān)性。Sheng等［13］測(cè)定血清DKK－1水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清DKK－1濃度比其他惡性腫瘤、肺部良性病變及健康對(duì)照組都高，且胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和宮頸癌患者血清DKK－1濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于健康對(duì)照組。此外還發(fā)現(xiàn)，血清DKK－1水平結(jié)合細(xì)胞角蛋白片段水平或NSE水平均能提高小細(xì)胞肺癌患者診斷的敏感性。Yamabuki等［14］也測(cè)定血清DKK－1水平，同時(shí)還用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織DKK－1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者血清DKK－1水平越高，預(yù)后越差。此外，DKK－1結(jié)合ProGRP可提高小細(xì)胞肺癌診斷的敏感性，認(rèn)為DKK－1可作為一種新的肺癌臨床診斷或預(yù)后的指標(biāo)，也有可能成為肺癌治療的新靶點(diǎn)。以上二者的觀點(diǎn)大致相同，都認(rèn)為DKK－1有作為血清標(biāo)志物的潛能。同時(shí)，當(dāng)它結(jié)合其他血清標(biāo)志物時(shí)，都能提高肺癌臨床診斷的敏感性，表明DKK－1有成為一種無創(chuàng)性的臨床診斷肺癌或判斷預(yù)后的血清標(biāo)志物的潛能。此外，Li等［15］通過RTPCR （reverse transcription－polymerase chain reaction，反轉(zhuǎn)錄酶－聚合酶聯(lián)鎖反應(yīng)）和 Westen blot（蛋白印跡試驗(yàn)）等技術(shù)檢測(cè)了10種人的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和小細(xì)胞肺癌組織中DKK－1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中DKK－1mRNA和蛋白水平均比臨近肺組織高；免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)DKK－1主要分布在癌細(xì)胞組織和細(xì)胞株的細(xì)胞漿中；DKK－1對(duì)癌細(xì)胞增殖沒有影響，但可能在癌細(xì)胞遷移和侵襲力方面有一定的作用；認(rèn)為DKK－1可能是非小細(xì)胞肺癌發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子，推測(cè)DKK－1可作為非小細(xì)胞肺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

2.3 DKK－1與其他腫瘤

多發(fā)性骨髓瘤以破骨細(xì)胞活性增加，成骨活細(xì)胞性降低為特征，其中骨病仍然是一個(gè)有待解決的主要問題。已有研究［16］證實(shí)，Wnt信號(hào)通路是骨骼形成以及維持骨骼內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要信號(hào)通路。DKK－1能破壞成骨細(xì)胞的分化和活性，從而阻止新生骨骼的形成。在多發(fā)性骨髓瘤中，DKK－1由多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生，尤其在廣泛骨浸潤的骨髓瘤微環(huán)境中高表達(dá)。研究［17］報(bào)道，多發(fā)性骨髓瘤患者血清中DKK－1高表達(dá)；Pozzi等［18］報(bào)道，DKK－1在多發(fā)性骨髓瘤患者血漿中高表達(dá)，其水平與國際通用的腫瘤分期、分級(jí)和有無溶骨性改變相關(guān)。筆者同時(shí)對(duì)鼠多發(fā)性骨髓瘤模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)使用抗－DKK－1中和抗體能明顯增加成骨細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)減少多核破骨細(xì)胞的數(shù)量和增加骨量，由此可推測(cè)，抗－DKK－1中和抗體與骨髓瘤細(xì)胞負(fù)荷相關(guān)，即抗－DKK－1抗體能間接抑制骨髓瘤細(xì)胞的破骨作用。DKK－1有望作為多發(fā)性骨髓瘤及其骨相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)，持續(xù)的臨床研究將有助于闡明其有效性。Qian等［19］研究發(fā)現(xiàn)DKK1－DNA疫苗能夠有效抑制骨髓瘤小鼠模型的進(jìn)一步發(fā)展和治療骨髓瘤，由此推測(cè)DKK－1可用于制作骨髓瘤免疫治療的新疫苗。Pozzi和Qian等的研究都在多發(fā)性骨髓瘤的治療方面提出了新思路，為多發(fā)性骨髓瘤患者的臨床免疫治療提供了一個(gè)很好的基本理論和平臺(tái)。

Ogoshi等［20］研究口腔鱗狀細(xì)胞癌DKK－1水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌細(xì)胞株及原發(fā)性口腔鱗癌患者組織中的DKK－1明顯高于正?；颊?；DKK－1陽性病例與低風(fēng)險(xiǎn)的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性；細(xì)胞經(jīng)敲除DKK－1基因后，其細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯高于DKK－1基因過表達(dá)者，這與DKK－1在其他腫瘤對(duì)細(xì)胞遷移及侵襲力方面的作用相反。該研究證實(shí)，DKK－1在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲力方面具有重要作用，可作為口腔鱗癌早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物。

DKK－1在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究。Li等［21］通過RT－PCR技術(shù)及 Western blot檢測(cè)食管癌患者的DKK－1mRNA及DKK－1蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：二者在食管癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織中的表達(dá)。此外，DKK－1的高表達(dá)增加了食管癌細(xì)胞的侵襲力，同時(shí)證實(shí)了DKK－1是食管癌進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)因子，它還可以作為食管癌治療的潛在靶點(diǎn)。Ssto等［22］對(duì)DKKs基因在胃腸道腫瘤中的表達(dá)及甲基化情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)DKK－1基因在結(jié)直腸癌組織中33%沉默，DKK－1基因甲基化表達(dá)在胃癌細(xì)胞系達(dá)38%，略低于肝細(xì)胞癌系及前列腺癌細(xì)胞系。Lee等［23］對(duì)胃癌患者組織及血清DKK－1表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組血清DKK－1濃度明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.001），腫瘤組織中DKK－1高表達(dá)與血清DKK－1高濃度具有相關(guān)性。血清及組織中DKK－1水平可協(xié)助診斷胃癌和判斷胃癌患者預(yù)后。在結(jié)直腸癌中，Soydinc等［24］通過ELISA方法對(duì)135例結(jié)腸癌、160例直腸癌及90例正常對(duì)照者血清中DKK－1水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DKK－1水平在三者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，血清DKK－1水平尚無作為診斷結(jié)直腸癌患者的潛力。

Chen等［25］通過免疫組織化學(xué)方法研究DKK－1基因在惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，DKK－1較正常皮膚表達(dá)低，DKK－1基因表達(dá)能抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞的侵襲活性。

DKK－1在多種腫瘤中均有表達(dá)，如宮頸癌［26］、激素抵抗型乳腺癌、腎癌和卵巢癌等。DKK－1可作為乳腺癌診斷的潛在指標(biāo)，對(duì)預(yù)后判斷也有一定的價(jià)值。

3 結(jié)語與展望

綜上所述，DKK－1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中通過不同的機(jī)制扮演著重要的角色。在不同的惡性腫瘤中DKK－1的表達(dá)或高或低，對(duì)惡性腫瘤的診斷具有一定的價(jià)值，也與大多數(shù)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)，但與腫瘤細(xì)胞增殖無關(guān)，是診斷潛在的惡性腫瘤的新指標(biāo)之一，也可能是惡性腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)之一。但許多研究仍然停留在基礎(chǔ)研究階段，在臨床應(yīng)用方面的研究有待進(jìn)一步推進(jìn)，比如醫(yī)學(xué)影像診斷技術(shù)聯(lián)合DKK－1在惡性腫瘤診斷方面的價(jià)值等。DKK－1在腫瘤中的進(jìn)一步研究有利于對(duì)不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制有更深入的了解，也可為臨床診斷及治療提供更可靠的依據(jù)。

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