兔富血小板血漿液制備及CaCl2誘導(dǎo)的比較

畢衡，楊立丁，包可，葉國(guó)裕，趙文韜，姚嘵

（云南省中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，昆明 650021）

富血小板血漿（PRP）是通過(guò)離心自體全血所得到的血小板濃縮物，當(dāng)血小板聚集激活后，釋放出多種與骨再生有關(guān)的生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、趨化和刺激血管化等多方面作用。利用血小板生長(zhǎng)因子刺激周圍骨再生，修復(fù)周圍骨缺損是國(guó)際醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。PRP因其制備簡(jiǎn)單、易獲取、無(wú)免疫原性及疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)在骨再生研究中受到越來(lái)越多的重視［1，2］。目前報(bào)道的PRP制備方法種類繁多，所制得的PRP中血小板濃度也有差別。本實(shí)驗(yàn)將采用3種簡(jiǎn)單的手工離心方式獲得PRP液，通過(guò)血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)，探討其相關(guān)性，測(cè)定活化前后PRP中血小板衍化生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）水平，評(píng)價(jià)不同方法所得PRP的活性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)在昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成，15只大耳白兔（許可合格證號(hào)：scxk（111）2008-24），體質(zhì)量2.1～2.6kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑

XE-2100血液分析儀及配套設(shè)備，低速常溫離心機(jī)（ThermoIEC CL40、美國(guó)），倒置顯微鏡（上海、TS100），酶標(biāo)儀（北京普朗酶標(biāo)儀DNM-9602G），移液器，枸櫞酸鈉，CaCl2，EDTA-K2抗凝管，PDGF、TGF-β1酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

咪達(dá)唑侖液0.5mg/kg耳緣靜脈緩注，待動(dòng)物麻醉起效后固定于手術(shù)臺(tái)。使用20mL無(wú)菌注射器和裝有枸櫞酸鈉5mL試管，心臟抽取血液至18 mL，將血液分別放入4個(gè)5mL離心管，每管4mL，其余2mL做全血對(duì)照，室溫靜置6h。采用一次離心法，即每管4mL對(duì)稱放置于離心機(jī)，用250g×10min離心，離心后吸取全部上清液移至另一EDTA-K2管，將白膜層交界面上下3mm移至另一離心管，即為PRP液。二次離心法用Landesberg法和 Aghaloo法進(jìn)行制備［3］。Landesberg法：第1次以200g×10min離心，取離心后白膜層以上及其下血漿3mm，置于另一離心管，再以200g×10 min進(jìn)行第2次離心，收集上清即貧血小板血漿，移至另一EDTA-K2離心管中，剩余0.4mL即PRP。Aghaloo法：第1次以215g×10min離心，第2次以863g×10min離心，余操作同上。

1.4 血小板濃度測(cè)量

PRP制備前后分別取全血及PRP各0.2mL，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀分別計(jì)數(shù)全血、一次離心PRP、二次離心Landesberg法和 Aghaloo法PRP中的血小板數(shù)量，反復(fù)兩次取平均值，并通過(guò)手工計(jì)數(shù)復(fù)核，同時(shí)記錄白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 PDGF、TGF-β1水平測(cè)定

PRP制備后10～15min，用10%CaCl2作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑1∶1（v/v）與PRP混合，室溫靜止10 min，酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）測(cè)定激活前后正常血漿、PRP中PDGF、TGF-β1水平，將收集的各組樣本按照ELISA說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。主要觀察指標(biāo)：3種方法制備的PRP中血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)；3組PRP液CaCl2誘導(dǎo)前后，PRP中PDGF、TGF-β1水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、PDGF、TGF-β1水平比較使用方差分析（ANOVA），并對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種方法制備PRP中血小板計(jì)數(shù)的比較

正常兔全血血小板計(jì)數(shù)為（255.33±47.07）×109/L，3種制備方法所得PRP中血小板計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（見表1）。

表1 PRP中血小板計(jì)數(shù)比較

2.2 三種方法制備PRP中白細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較

正常兔全血白細(xì)胞計(jì)數(shù)為（5.62±1.03）×109/L，兔全血白細(xì)胞數(shù)受體溫影響較大，3種制備方法所得PRP中白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（見表2）。

2.3 PRP中PDGF比較

樣品稀釋后，用純化的兔PDGF 48孔抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入PDGF，再與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的PDGF抗體結(jié)合，形成抗體－抗原－酶標(biāo)抗體復(fù)合物。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中兔PDGF濃度。激活前3種離心方法組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CaCl2激活后，3種離心方法組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且Aghaloo法PDGF含量最高。Landesberg法、Aghaloo法激活前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表3）。

表2 PRP中白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

表3 PRP中PDGF比較（±s，μg/L）

表3 PRP中PDGF比較（±s，μg/L）

與激活前比較，＊P＜0.05

組別 PDGF（激活前） PDGF（激活后）9.33±0.77 9.50±0.58 Landesberg法 9.43±0.47 11.03±0.46＊Aghaloo法 9.53±0.37 12.50±1.18＊P值 ＞0.05 ＜一次離心法0.01

2.4 PRP中TGF－β1比較

激活前3種離心方法組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），激活后3種離心方法組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且 Aghaloo法 TGF－β1含量最高。Landesberg法、Aghaloo法激活前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表4）。

表4 PRP中TGF－β1的比較（±s，μg/L）

表4 PRP中TGF－β1的比較（±s，μg/L）

與激活前比較，＊P＜0.05

組別 TGF-β1（激活前） TGF-β1（激活后）48.02±3.31 74.20± 8.34 Landesberg法 47.89±3.50 105.04±10.46＊Aghaloo法 47.93±4.08 125.16±23.97＊P值 ＞0.05 ＜一次離心法0.01

3 討論

目前PRP的提取和制備方法呈現(xiàn)多樣化和成熟化，成熟的制備方法由于設(shè)備成本昂貴，對(duì)于小成本實(shí)驗(yàn)研究來(lái)說(shuō)，手工制備方法仍然使用比較多，但存在血小板質(zhì)量容易波動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)。完善的操作程序有助于質(zhì)量控制，從本實(shí)驗(yàn)來(lái)看程序應(yīng)該包括：1）釆血的準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)采用心臟取血，力求一針成功，可以得到足夠的全血，用于制備；2）實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定的溫度。室溫應(yīng)該在20～25℃，抽血器及試管應(yīng)該接近實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體溫，這樣可以防止血液中出現(xiàn)凝血塊，影響血小板分離；3）第1次離心非常重要。離心過(guò)程如果不能形成分層（白膜層形成），則分離失敗，因此，第1次離心時(shí)間不能太長(zhǎng)，防止離心出現(xiàn)凝塊，影響分離質(zhì)量；4）取白膜層上下3mm的血液。人工制備由于條件差，程序控制非常重要。

對(duì)于富血小板的有效濃度，目前認(rèn)為應(yīng)該為全血血小板的3～4倍。本實(shí)驗(yàn)3種離心方法，其中Aghaloo法所獲得的血小板數(shù)最高；一次離心法稍低于其有效濃度，但是一次離心法手工操作最穩(wěn)定，重復(fù)實(shí)驗(yàn)率較低；而Landesberg法、Aghaloo法受手工操作的程序影響，有時(shí)需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

PRP液主要成分包括血小板、白細(xì)胞和纖維蛋白，其中白細(xì)胞含量較大，為正常全血的4～6倍。大量的白細(xì)胞具有防止感染及免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)白細(xì)胞具有很強(qiáng)的黏附能力，能使多種因子在其表面形成多格結(jié)構(gòu)，不容易脫落［4－6］。PRP液激活可以產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如 PDGF、TGF-β1、VEGF、EGF和IGF等［7，8］，而激活劑一直倍受爭(zhēng)議。自然的凝固是對(duì)富血小板血漿液影響最小的方法，采用CaCl2拮抗枸櫞酸鈉使血液自行凝固，血小板自發(fā)的被激活，釋放生長(zhǎng)因子，而在常溫下激活的生長(zhǎng)因子的衰減與體內(nèi)有些相似［2，9，10］。從本組實(shí)驗(yàn)來(lái)看使用Aghaloo法、Landesberg法中所得的生長(zhǎng)因子在激活后是有效的。因此，將PRP液置入機(jī)體內(nèi)，產(chǎn)生凝血現(xiàn)象，自身也可以激活并釋放生長(zhǎng)因子，印證了臨床使用PRP液不需要添加激活劑，仍能起到治療作用。

PRP液的機(jī)理研究非常復(fù)雜，但其作用是肯定的，采用不干擾其生物機(jī)能的方法進(jìn)行研究將是今后的一個(gè)方向。

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