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    肌上皮細(xì)胞在腮腺再生過(guò)程中的變化

    2014-03-24 07:48:10毛玉龍張偉偉左金華
    華西口腔醫(yī)學(xué)雜志 2014年5期
    關(guān)鍵詞:腺泡腮腺小葉

    毛玉龍 張偉偉 左金華

    1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科;2.口腔正畸科,濱州 256603

    放射治療、舍格倫綜合征以及涎腺炎導(dǎo)致的涎腺萎縮是臨床上常見且亟待解決的難題。研究涎腺對(duì)萎縮和再生的反應(yīng)有可能為涎腺的放射防護(hù)設(shè)計(jì)或?yàn)橄严傥s的治療找到有效的途徑[1]。有學(xué)者[2]認(rèn)為,肌上皮細(xì)胞(myoepithelial cell,MEC)可能是導(dǎo)致唾液腺多種疾病的潛能祖細(xì)胞之一;在繼發(fā)性舍格倫綜合征患者唾液腺炎癥病變過(guò)程中,MEC亦可作為靶細(xì)胞被淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)破壞,并最終導(dǎo)致腺泡和導(dǎo)管上皮喪失[3]。目前關(guān)于MEC在腮腺萎縮后再生過(guò)程中變化方面的研究較少,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)扎大鼠腮腺主導(dǎo)管14 d后使其再通,建立腮腺萎縮后再生的動(dòng)物模型,觀察MEC在該過(guò)程中的數(shù)量及分布的變化情況。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

    選用無(wú)特定病原體動(dòng)物(specif ied pathogen free,SPF)級(jí)成年雄性Wistar大鼠54只為研究對(duì)象,質(zhì)量(260±15)g,購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(批號(hào):魯動(dòng)質(zhì)字D20021024)。將大鼠隨機(jī)分為8個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)正常對(duì)照組,每組6只,常規(guī)飼養(yǎng)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    將實(shí)驗(yàn)組的大鼠使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%水合氯醛(10 mL·kg-1)行腹腔內(nèi)注射麻醉,于右耳前下方切開皮膚,顯露右側(cè)腮腺主導(dǎo)管,用3—0絲線將直徑0.8 mm醫(yī)用鋼絲與主導(dǎo)管捆綁雙重結(jié)扎。主導(dǎo)管結(jié)扎后第14天,再次麻醉大鼠,取出醫(yī)用鋼絲使主導(dǎo)管再通,分別于再通后第0、1、3、5、7、10、14、21天各處死1組大鼠,切取右側(cè)腮腺,放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定液中固定。正常對(duì)照組僅手術(shù)顯露主導(dǎo)管但不結(jié)扎。

    1.3 觀察方法

    1.3.1 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察 將各組腮腺組織樣本固定24 h后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,然后浸蠟、包埋,制成4 μm厚切片,進(jìn)行HE染色,置于光學(xué)顯微鏡下觀察腮腺的組織學(xué)變化。

    1.3.2 免疫組織化學(xué)染色觀察 采用特異性肌動(dòng)蛋白α-SMA單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),應(yīng)用SABC法對(duì)腮腺標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,抗體稀釋度為1∶200,DAB顯色,蘇木精輕度復(fù)染,觀察MEC的陽(yáng)性表達(dá)情況。

    1.3.3 MEC計(jì)數(shù) 將免疫組織化學(xué)切片置于OLYMPUS BX51型顯微鏡下(Olympus公司,日本)觀察,每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)數(shù)MEC的數(shù)目。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 HE觀察結(jié)果

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的HE觀察結(jié)果見圖1。正常對(duì)照組:腮腺腺小葉中有密集的腺泡細(xì)胞及散在的導(dǎo)管系統(tǒng)(閏管、紋管及排泄管),腺泡細(xì)胞大小均勻,排列緊湊(圖1A)。實(shí)驗(yàn)組:導(dǎo)管結(jié)扎14 d組(即再通0 d組),腮腺實(shí)質(zhì)內(nèi)絕大多數(shù)腺泡萎縮消失,僅在腺小葉邊緣可見少數(shù)散在且體積明顯減小的腺泡細(xì)胞,導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯增多,占據(jù)腺小葉的大部,并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B);再通1 d組與再通0 d組相比,腺小葉結(jié)構(gòu)未見明顯變化;再通3 d組可見體積較小的新生腺泡出現(xiàn)在腺小葉邊緣(圖1C);再通5 d組可見除腺小葉邊緣外,腺小葉中央新生腺泡數(shù)量也明顯增多,導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯減少;再通7 d組,成熟的腺泡細(xì)胞已占據(jù)大部分腺小葉,腺泡形態(tài)基本恢復(fù)正常,但腺泡排列仍較正常對(duì)照組稀疏(圖1D);再通10 d組,成熟腺泡進(jìn)一步增多,導(dǎo)管系統(tǒng)進(jìn)一步減少;再通14 d組及再通21 d組,腺小葉的結(jié)構(gòu)與正常對(duì)照組相近,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯差異。

    圖1 正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組腮腺的組織學(xué)變化 HE× 400Fig 1 Histological changes of parotid glands for control and experimental group HE× 400

    2.2 免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果

    正常對(duì)照組:呈陽(yáng)性表達(dá)的MEC主要分布在閏管及腺泡周圍,形態(tài)呈星形或梭形,紋管周圍亦可見少量MEC(圖2A);再通0 d組與正常對(duì)照組比較,MEC數(shù)目明顯增多,主要分布在大量導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)周圍,此時(shí)導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)呈典型的雙套層結(jié)構(gòu),大量MEC位于外層,形態(tài)呈梭形或星形(圖2B);再通1 d組與再通0 d組對(duì)比,MEC數(shù)目及分布未見明顯改變;再通3 d組,隨著新生腺泡的出現(xiàn),MEC數(shù)目明顯減少,大多分布在導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)及新生腺泡周圍(圖2C);再通5 d組,新生腺泡逐漸增多,導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯減少,MEC數(shù)目進(jìn)一步明顯減少;再通7 d組,新生腺泡已占據(jù)大部分腺小葉,導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯減少,MEC數(shù)目減少變緩,主要分布在體積較小的新生腺泡及導(dǎo)管系統(tǒng)表面(圖2D);再通10 d組,MEC數(shù)量進(jìn)一步減少;再通14 d組及21 d組,腺小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常,MEC數(shù)目及分布也基本恢復(fù)正常,與正常對(duì)照組未見明顯差別。

    圖2 正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組腮腺M(fèi)EC的陽(yáng)性表達(dá) SABC× 400Fig 2 MEC positive expression in parotid glands for control and experimental group SABC× 400

    2.3 MEC計(jì)數(shù)結(jié)果

    各組動(dòng)物的MEC計(jì)數(shù)結(jié)果見表1:與正常對(duì)照組相比,再通0、1、3、5、7、10 d組的MEC數(shù)量均有明顯差異(P<0.05),再通14 d及21 d組無(wú)明顯差異(P>0.05);再通3、5 d時(shí)MEC數(shù)量下降最為明顯,再通7 d開始,MEC數(shù)量下降明顯放緩。

    表1 腮腺再生過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的MEC計(jì)數(shù)Tab 1 Numbers of MEC during each step of duct reopening ±s

    表1 腮腺再生過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的MEC計(jì)數(shù)Tab 1 Numbers of MEC during each step of duct reopening ±s

    注:*與正常對(duì)照組相比,P<0.05。

    組別MEC數(shù)量正常對(duì)照550.40±80.465再通0 d1 584.30±180.426*再通1 d1 504.62±205.847*再通3 d1 242.55±272.810*再通5 d891.25±312.467*再通7 d765.50±245.214*再通10 d688.64±166.376*再通14 d611.26±154.379再通21 d584.50±138.589

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)按照潘光華等[4]的實(shí)驗(yàn)方法,將醫(yī)用鋼絲捆綁結(jié)扎于大鼠腮腺主導(dǎo)管,14 d后取出鋼絲使導(dǎo)管再通,成功制造了腮腺萎縮后再生的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)觀察到,主導(dǎo)管結(jié)扎后14 d,腺泡細(xì)胞幾乎全部消失,取而代之的是腺體內(nèi)出現(xiàn)了大量的導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu),腺實(shí)質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),僅在腺小葉邊緣殘留少量的腺泡細(xì)胞。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法,觀察到MEC的數(shù)量明顯增多,幾乎全部分布于導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的周圍,呈雙套層樣結(jié)構(gòu),形態(tài)呈梭形或星形。這與趙騰達(dá)等[5]的觀察結(jié)果是一致的。

    主導(dǎo)管結(jié)扎后腺體萎縮的機(jī)理目前仍然不明確。大部分學(xué)者[6-7]認(rèn)為,這是由于細(xì)胞自身的凋亡造成的;但Fujita-Yoshigaki等[8]發(fā)現(xiàn),涎腺萎縮過(guò)程中,腺泡細(xì)胞可通過(guò)Src-p38MAPs信號(hào)傳導(dǎo)通路快速轉(zhuǎn)變?yōu)閷?dǎo)管樣細(xì)胞。還有學(xué)者[9]通過(guò)分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在涎腺萎縮過(guò)程中,導(dǎo)管細(xì)胞因過(guò)表達(dá)抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(B-cell lymphoma/leukemia,Bcl)基因未發(fā)生凋亡,而腺泡細(xì)胞由于表達(dá)Bcl相關(guān)X蛋白Bax而促進(jìn)其自身的凋亡。

    Burgess等[10]指出,在腺體萎縮過(guò)程中,MEC能在一定程度上抑制腺體的萎縮。MEC內(nèi)含有肌動(dòng)蛋白,能夠發(fā)生收縮,促進(jìn)腺泡及導(dǎo)管的分泌[11]。大量研究發(fā)現(xiàn),MEC在正常狀況下增殖率很低,當(dāng)腺體受到損傷時(shí)則出現(xiàn)快速增殖。Walker等[12]發(fā)現(xiàn),在正常唾液腺內(nèi)很少觀察到MEC,但隨著腺體進(jìn)行性萎縮,MEC陽(yáng)性表達(dá)明顯,并最終完全圍繞在導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)周圍。本研究中,主導(dǎo)管結(jié)扎14 d后,腺泡細(xì)胞大量消失,而MEC數(shù)量不減反增,說(shuō)明MEC在抑制腺體萎縮方面發(fā)揮了重要作用。筆者推測(cè)出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因在于,當(dāng)導(dǎo)管發(fā)生阻塞時(shí),導(dǎo)管內(nèi)的壓力增加,腺泡細(xì)胞不再需要MEC促進(jìn)分泌,為了抵抗導(dǎo)管阻塞帶來(lái)的壓力,MEC大量增殖,并圍繞在導(dǎo)管周圍;同時(shí)由于腺體萎縮,單位視野中MEC數(shù)量相對(duì)增多。關(guān)于大量增生的MEC的來(lái)源,目前存在兩種觀點(diǎn):一是導(dǎo)管細(xì)胞作為潛能細(xì)胞大量分化為MEC,二是原來(lái)位于腺泡周圍的MEC發(fā)生了移行。至于具體原因還需要進(jìn)一步研究。

    本實(shí)驗(yàn)觀察到,主導(dǎo)管再通第1天至第5天時(shí),導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯減少,體積較小的新生腺泡細(xì)胞自腺小葉邊緣開始大量增殖;究其來(lái)源,大部分學(xué)者[13]認(rèn)為是由閏管儲(chǔ)備細(xì)胞分化而來(lái),筆者認(rèn)為,腺小葉周圍殘余的腺泡細(xì)胞主動(dòng)增殖分化也是其大量增殖的原因之一。此階段MEC數(shù)量減少最為明顯,且主要分布在新生腺泡周圍,故筆者推測(cè),腮腺的再生主要發(fā)生在主導(dǎo)管再通后的5 d內(nèi)。再通第7天,隨著腺體的再生恢復(fù),MEC數(shù)量減少的程度不如前期明顯,形態(tài)也逐漸恢復(fù)正常,主要分布在體積較小的新生腺泡及殘存的導(dǎo)管樣組織周圍。再通14 d時(shí),鏡下觀察到的腺實(shí)質(zhì)內(nèi)各解剖結(jié)構(gòu)及MEC已基本恢復(fù)正常。

    綜上所述,本研究通過(guò)建立腮腺萎縮后再通的動(dòng)物模型,成功觀察到腮腺萎縮后再生過(guò)程中MEC及腺小葉中各結(jié)構(gòu)的組織學(xué)變化,為研究腮腺導(dǎo)管阻塞后再通的變化提供理論依據(jù),并為進(jìn)一步研究腮腺萎縮的治療打下基礎(chǔ)。

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