牛腸道病毒RT—PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

劉曉等

摘要：參照GenBank中登錄的牛腸道病毒（BEV）全基因組序列，針對(duì)其3D基因設(shè)計(jì)合成了1對(duì)特異性引物，提取病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)條件優(yōu)化，建立了BEV的RT-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的特異性、敏感性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，該方法從分離的牛腸道病毒中擴(kuò)增出了732 bp的特異性目的片段；且對(duì)牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛輪狀病毒（BRV）、牛冠狀病毒（BCoV）等相關(guān)病毒均無交叉反應(yīng)；其檢出敏感度達(dá)10-1TCID50。應(yīng)用該方法對(duì)山東地區(qū)84份臨床疑似發(fā)病牛樣品進(jìn)行檢測(cè)，21份為陽性，陽性檢出率為25%。

關(guān)鍵詞：牛腸道病毒；3D基因；RT-PCR；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S852.65+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）02-0013-04

牛腸道病毒（Bovine enterovirus， BEV）屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬，呈球形，大小為25～30 nm，是無囊膜單股正鏈RNA病毒[1]。自1959年Moll和Davis[2]首次分離到BEV以來，很多國(guó)家和地區(qū)先后報(bào)道了牛腸道病毒的感染情況[3～5]。腸道病毒是脊椎動(dòng)物腸道中原有的棲居者，可以從患腸道疾病、肺炎、呼吸系統(tǒng)疾病和生殖障礙疾病的牛分泌物或排泄物中分離獲得，也可以從正常牛的糞便樣品中分離，還存在于牛糞便污染的環(huán)境或水體中，常作為糞便污染指示劑[6]。

據(jù)研究報(bào)道，牛腸道病毒在國(guó)外牛群中的陽性率約為17.6%～80%[7]，而在我國(guó)，有關(guān)此病的病原學(xué)及流行病學(xué)調(diào)查的報(bào)道很少。近年來，山東省周邊某些牛場(chǎng)發(fā)生了以水樣和血便等嚴(yán)重腹瀉為特征的疾病，致使奶牛的食欲和產(chǎn)奶量大幅下降。本研究結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的牛腸道病毒基因和GenBank登錄的牛腸道病毒全基因組序列，針對(duì)其3D基因的相對(duì)保守區(qū)域，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立了牛腸道病毒的RT-PCR檢測(cè)方法，并初步應(yīng)用于臨床送檢樣本的檢測(cè)，具有較好的敏感性和特異性，為國(guó)內(nèi)牛腸道病毒的臨床檢測(cè)及流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供了有力支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1毒株和樣品來源病料樣品為山東省某牛場(chǎng)發(fā)生腹瀉癥狀的病牛糞便。BVDV Oregon C24V 病毒株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛腸道病毒（BEV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、牛輪狀病毒（BRV）、牛冠狀病毒（BcoV）、MDBK正常細(xì)胞等均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心保存。臨床組織樣品來自牛場(chǎng)送檢的疑似發(fā)病樣品，共84份，主要包括血液、糞便、淋巴結(jié)、腸等。

1.1.2主要試劑生理鹽水、青霉素、鏈霉素購(gòu)自Hyclone公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；rTaq DNA 聚合酶、dNTP、RNA酶抑制劑、DNA Marker DL2000購(gòu)自寶生物工程（大連） 有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank已登錄的BEV K2577株（AF123432）、SL305株（AF123433）、VG-5-27株（NC_001859）等毒株的全序列，分析BEV 3D基因的保守區(qū)，設(shè)計(jì)引物BEVF：5′GAGCCCAGTGTTTTCTTTGATGTTTTC3′和BEVR： 5′AAAGTTGATCAATAAAGTGCTTGCA3′，擴(kuò)增片段大小為732 bp。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，稀釋成20 μmol/L，-20℃保存。

1.2.2病料處理將病料按1∶5加入滅菌生理鹽水研磨，經(jīng)反復(fù)凍融后，按每毫升加入青霉素、鏈霉素各1 000單位，以3 000 r/min離心20 min，取上清液用于試驗(yàn)或-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3病毒RNA的提取取200 μl病料處理液，按EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書進(jìn)行操作。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄合成cDNA將提取的RNA按照 TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)方法的建立以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR 反應(yīng)體系（模板、酶、引物、鎂離子、dNTPs的濃度）、反應(yīng)條件（變性、退火、延伸的溫度及循環(huán)次數(shù)）進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，確定最佳PCR反應(yīng)條件。

1.2.6RT-PCR 特異性試驗(yàn)應(yīng)用建立的RT-PCR方法分別對(duì)BEV、BVDV、IBRV、BCoV、BRV、MDBK正常細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該檢測(cè)方法的特異性。

1.2.7病毒的培養(yǎng)選擇細(xì)胞形態(tài)良好的MDBK單層細(xì)胞，棄去營(yíng)養(yǎng)液后用PBS清洗細(xì)胞。按照1%的細(xì)胞培養(yǎng)量接種病料處理液，于37℃感作1 h，棄去感作液，加入維持液（2%新生馬血清的DMEM），于5%CO2、37℃培養(yǎng)，12 h觀察細(xì)胞病變，培養(yǎng)24 h后收毒。細(xì)胞培養(yǎng)毒反復(fù)凍融3次后再次接種易感細(xì)胞，如此傳3代，收獲的細(xì)胞毒用于其他試驗(yàn)[8]。以未接毒的MDBK細(xì)胞為對(duì)照。

1.2.8RT-PCR敏感性試驗(yàn)將BEV RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后，分別取10 μl進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證該檢測(cè)方法的敏感性。

1.2.9臨床樣本的檢測(cè)應(yīng)用優(yōu)化建立的牛腸道病毒RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)山東地區(qū)84份臨床疑似發(fā)病牛樣品進(jìn)行檢測(cè)，將檢出的陽性樣本RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的特異性。

2結(jié)果與分析

2.1RT-PCR擴(kuò)增及鑒定

對(duì)臨床發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的病牛糞便樣本處理后，提取病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)優(yōu)化，建立了最佳的PCR反應(yīng)體系： 10×PCR Buffer（MgCl2 Plus） 3 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μl，BEV-F （20 μmol/L） 0.5 μl，BEV-R（20 μmol/L） 0.5 μl，rTaq （5 U/μl） 0.25 μl，cDNA 2 μl，RNA/DNA-Free Water 19.75 μl，總體積30 μl；PCR最佳反應(yīng)條件為94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，31個(gè)循環(huán)。

利用該體系擴(kuò)增獲得了約732 bp的目的片段（圖1），與預(yù)期相符。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。結(jié)果表明，擴(kuò)增片段與GenBank中收錄的BEV VG-5-27株部分3D基因的同源性達(dá)82%。

3討論

牛腸道病毒（BEV）可以導(dǎo)致牛發(fā)生多種綜合征，為及時(shí)減輕該病毒對(duì)奶牛生產(chǎn)性能的影響，建立快速、有效的檢測(cè)方法是非常有必要的。目前已報(bào)道的BEV檢測(cè)技術(shù)主要有電鏡檢查、病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)和TaqMan熒光定量PCR等，這些方法存在使用的儀器設(shè)備昂貴，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，耗費(fèi)人力、物力等缺點(diǎn)[9～11]，因此，迫切需要建立一種快速、敏感、特異的檢測(cè)方法來解決生產(chǎn)實(shí)際中的問題。

近年隨著PCR診斷技術(shù)的建立及廣泛應(yīng)用，許多研究者已經(jīng)將PCR技術(shù)應(yīng)用于多種病毒性疾病的檢測(cè)，并且取得了一定的成績(jī)[12]。腸道病毒基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，本研究建立的RT-PCR檢測(cè)方法主要基于3D基因的相對(duì)保守序列設(shè)計(jì)引物，用該方法檢測(cè)BEV，可以檢測(cè)出10-1TCID50的BEV樣品，敏感性高于病毒分離法；同時(shí)具有良好的特異性，檢測(cè)BVDV、IBRV、BRV、BCoV、MDBK細(xì)胞等均為陰性；且病毒樣品RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄到PCR擴(kuò)增以及電泳檢測(cè)，全部過程用時(shí)較短，可方便快捷地診斷出BEV感染，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。

利用該RT-PCR方法對(duì)山東省送檢的84份臨床疑似發(fā)病牛樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢出21份陽性，陽性檢出率為25%，表明牛腸道病毒感染在我國(guó)部分地區(qū)的牛群中普遍存在，且危害相當(dāng)嚴(yán)重。隨機(jī)選取4個(gè)陽性樣品進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果也證實(shí)為BEV，進(jìn)一步表明該方法具有較高的敏感性和特異性。該RT-PCR方法不僅可用于BEV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)或診斷，還可用于BEV的流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測(cè)等，為BEV的防控奠定了基礎(chǔ)。

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對(duì)臨床發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的病牛糞便樣本處理后，提取病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)優(yōu)化，建立了最佳的PCR反應(yīng)體系： 10×PCR Buffer（MgCl2 Plus） 3 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μl，BEV-F （20 μmol/L） 0.5 μl，BEV-R（20 μmol/L） 0.5 μl，rTaq （5 U/μl） 0.25 μl，cDNA 2 μl，RNA/DNA-Free Water 19.75 μl，總體積30 μl；PCR最佳反應(yīng)條件為94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，31個(gè)循環(huán)。

利用該體系擴(kuò)增獲得了約732 bp的目的片段（圖1），與預(yù)期相符。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。結(jié)果表明，擴(kuò)增片段與GenBank中收錄的BEV VG-5-27株部分3D基因的同源性達(dá)82%。

3討論

牛腸道病毒（BEV）可以導(dǎo)致牛發(fā)生多種綜合征，為及時(shí)減輕該病毒對(duì)奶牛生產(chǎn)性能的影響，建立快速、有效的檢測(cè)方法是非常有必要的。目前已報(bào)道的BEV檢測(cè)技術(shù)主要有電鏡檢查、病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)和TaqMan熒光定量PCR等，這些方法存在使用的儀器設(shè)備昂貴，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，耗費(fèi)人力、物力等缺點(diǎn)[9～11]，因此，迫切需要建立一種快速、敏感、特異的檢測(cè)方法來解決生產(chǎn)實(shí)際中的問題。

近年隨著PCR診斷技術(shù)的建立及廣泛應(yīng)用，許多研究者已經(jīng)將PCR技術(shù)應(yīng)用于多種病毒性疾病的檢測(cè)，并且取得了一定的成績(jī)[12]。腸道病毒基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，本研究建立的RT-PCR檢測(cè)方法主要基于3D基因的相對(duì)保守序列設(shè)計(jì)引物，用該方法檢測(cè)BEV，可以檢測(cè)出10-1TCID50的BEV樣品，敏感性高于病毒分離法；同時(shí)具有良好的特異性，檢測(cè)BVDV、IBRV、BRV、BCoV、MDBK細(xì)胞等均為陰性；且病毒樣品RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄到PCR擴(kuò)增以及電泳檢測(cè)，全部過程用時(shí)較短，可方便快捷地診斷出BEV感染，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。

利用該RT-PCR方法對(duì)山東省送檢的84份臨床疑似發(fā)病牛樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢出21份陽性，陽性檢出率為25%，表明牛腸道病毒感染在我國(guó)部分地區(qū)的牛群中普遍存在，且危害相當(dāng)嚴(yán)重。隨機(jī)選取4個(gè)陽性樣品進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果也證實(shí)為BEV，進(jìn)一步表明該方法具有較高的敏感性和特異性。該RT-PCR方法不僅可用于BEV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)或診斷，還可用于BEV的流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測(cè)等，為BEV的防控奠定了基礎(chǔ)。

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對(duì)臨床發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的病牛糞便樣本處理后，提取病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)優(yōu)化，建立了最佳的PCR反應(yīng)體系： 10×PCR Buffer（MgCl2 Plus） 3 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μl，BEV-F （20 μmol/L） 0.5 μl，BEV-R（20 μmol/L） 0.5 μl，rTaq （5 U/μl） 0.25 μl，cDNA 2 μl，RNA/DNA-Free Water 19.75 μl，總體積30 μl；PCR最佳反應(yīng)條件為94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，31個(gè)循環(huán)。

利用該體系擴(kuò)增獲得了約732 bp的目的片段（圖1），與預(yù)期相符。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。結(jié)果表明，擴(kuò)增片段與GenBank中收錄的BEV VG-5-27株部分3D基因的同源性達(dá)82%。

3討論

牛腸道病毒（BEV）可以導(dǎo)致牛發(fā)生多種綜合征，為及時(shí)減輕該病毒對(duì)奶牛生產(chǎn)性能的影響，建立快速、有效的檢測(cè)方法是非常有必要的。目前已報(bào)道的BEV檢測(cè)技術(shù)主要有電鏡檢查、病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)和TaqMan熒光定量PCR等，這些方法存在使用的儀器設(shè)備昂貴，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，耗費(fèi)人力、物力等缺點(diǎn)[9～11]，因此，迫切需要建立一種快速、敏感、特異的檢測(cè)方法來解決生產(chǎn)實(shí)際中的問題。

近年隨著PCR診斷技術(shù)的建立及廣泛應(yīng)用，許多研究者已經(jīng)將PCR技術(shù)應(yīng)用于多種病毒性疾病的檢測(cè)，并且取得了一定的成績(jī)[12]。腸道病毒基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，本研究建立的RT-PCR檢測(cè)方法主要基于3D基因的相對(duì)保守序列設(shè)計(jì)引物，用該方法檢測(cè)BEV，可以檢測(cè)出10-1TCID50的BEV樣品，敏感性高于病毒分離法；同時(shí)具有良好的特異性，檢測(cè)BVDV、IBRV、BRV、BCoV、MDBK細(xì)胞等均為陰性；且病毒樣品RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄到PCR擴(kuò)增以及電泳檢測(cè)，全部過程用時(shí)較短，可方便快捷地診斷出BEV感染，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。

利用該RT-PCR方法對(duì)山東省送檢的84份臨床疑似發(fā)病牛樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢出21份陽性，陽性檢出率為25%，表明牛腸道病毒感染在我國(guó)部分地區(qū)的牛群中普遍存在，且危害相當(dāng)嚴(yán)重。隨機(jī)選取4個(gè)陽性樣品進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果也證實(shí)為BEV，進(jìn)一步表明該方法具有較高的敏感性和特異性。該RT-PCR方法不僅可用于BEV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)或診斷，還可用于BEV的流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測(cè)等，為BEV的防控奠定了基礎(chǔ)。

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