含氮碳量子點(diǎn)的電化學(xué)制備及其在銅離子檢測(cè)中的應(yīng)用

羅宗乾，張艮，劉芳玲，王榮

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234）

0 引言

碳量子點(diǎn)是尺寸小于10 nm分散的類(lèi)球形熒光碳納米顆粒[1]，是熒光碳納米材料中最主要的一種[2～8]。與傳統(tǒng)的染料分子和半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，它不僅熒光強(qiáng)而穩(wěn)定、耐光漂白、無(wú)光閃爍現(xiàn)象，而且激發(fā)光譜寬而連續(xù)，可實(shí)現(xiàn)一元激發(fā)多元發(fā)射。其低毒特性，良好的生物相容性和環(huán)境安全性以及水溶性確保了碳量子點(diǎn)可以放心地應(yīng)用于活體細(xì)胞的檢測(cè)，不用擔(dān)心熒光材料對(duì)活體細(xì)胞的影響而導(dǎo)致誤診，也可以長(zhǎng)時(shí)間研究細(xì)胞中生物分子之間的相互作用[9]。與無(wú)機(jī)量子點(diǎn)相似[10]，碳量子點(diǎn)的發(fā)射光譜跨度很大，從可見(jiàn)光譜區(qū)一直延伸到近紅外光譜區(qū)[11]，這個(gè)優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了普通熒光試劑在近紅外光譜區(qū)品種少的不足[1,12]。此外，碳量子點(diǎn)既可用于單光子成像，又可用于雙光子成像，有望替代無(wú)機(jī)量子點(diǎn)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最具應(yīng)用前景的環(huán)境友好型熒光納米材料。目前，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道碳量子點(diǎn)被用作熒光探針應(yīng)用于細(xì)胞和活體的熒光觀測(cè)[13～15]。

已報(bào)道的碳量子點(diǎn)合成方法有很多[9,11,13,14]，電化學(xué)方法合成碳量子點(diǎn)由于操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、可重復(fù)性強(qiáng)、產(chǎn)品穩(wěn)定，不必進(jìn)行進(jìn)一步的修飾處理，只需要離心分離就可以得到發(fā)光碳納米顆粒，而被許多研究者采用。在電化學(xué)法制備碳納米顆粒的過(guò)程中，工作電極一般為導(dǎo)電的碳素材料，在一定的電流或電勢(shì)下，借助電解液陽(yáng)極氧化，從工作電極上剝離下細(xì)小的碳納米顆粒[16]。2007年Zhou課題組[17]通過(guò)電化學(xué)的方法電解多壁碳納米管制備發(fā)光碳量子點(diǎn)。以四丁銨高氯酸鹽(TBAP)的脫氣乙腈溶液為支持電解質(zhì)，多壁碳納米管做工作電極、鉑電極做對(duì)電極、Ag/AgClO4做參比電極，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)觀察電解液的溶液變化來(lái)控制合成的進(jìn)度，反應(yīng)得到的碳量子點(diǎn)粒徑大小在2.8 nm左右，該碳量子點(diǎn)具有良好的水溶性。Lee課題組[18]是通過(guò)電化學(xué)的方法氧化石墨棒來(lái)制備熒光碳量子點(diǎn)，通入直流電源，陰陽(yáng)極都用石墨棒做電極，配成100 mL的溶液（乙醇∶水=99.5∶0.5），慢慢加入氫氧化鈉（0.2～0.4 g），電流密度控制在10～200 mA/cm2,可以制的熒光強(qiáng)度很強(qiáng)的碳量子點(diǎn)，他們是通過(guò)控制電流密度的大小來(lái)控制碳量子點(diǎn)的顆粒大小。Chi課題組[19]是通過(guò)電解石墨棒的方法來(lái)制備發(fā)光的碳量子點(diǎn)。石墨棒做工作電極、鉑網(wǎng)做對(duì)電極、Ag/AgClO4做參比電極，在磷酸緩沖溶液中（pH7.0），控制電壓-3 V～+3 V用循環(huán)伏安掃描的方法，制備碳量子點(diǎn)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，溶液的顏色由黃色逐漸變化到深褐色，最后得到的碳量子點(diǎn)粒徑大小為2 nm左右。Du等[20]以石墨棒為工作電極和對(duì)電極，Ag/AgCl(1 mol/L KCl)電極為參比電極，分別置于0.1 mol/L的乙醇鈉的乙醇溶液的電解液中。在0～10 V電壓下(掃速：0.5 V/s)循環(huán)伏安法電解60 min，溶液由無(wú)色變?yōu)辄S色，最后到暗棕色。透析除去乙醇鈉獲得尺寸3.12 nm、發(fā)藍(lán)綠光的碳量子點(diǎn)。作者認(rèn)為該碳量子點(diǎn)的發(fā)光機(jī)理主要是碳納米顆粒含有穩(wěn)定的富氧基團(tuán)。Kang等[21]將無(wú)水乙醇與蒸餾水按體積比為10∶90混合，再加入NaOH配制得到電解液；在直流電作用下反應(yīng)2～4 h，并通過(guò)柱層分析法分離得到碳量子點(diǎn)。該量子點(diǎn)直徑小于3 nm，具有較強(qiáng)的藍(lán)綠色熒光(量子產(chǎn)率約為12%)，并且指出不同的電流密度可以粗略控制碳量子點(diǎn)的發(fā)光。

常見(jiàn)的碳量子點(diǎn)通常以乙醇、葡萄糖等含氧化合物作為碳源。最近，Ma[22]與Liu課題組[23]分別用葡萄糖和4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine(TTDDA)，丙三醇和TTDDA通過(guò)微波輔助的方法，合成了含氮的碳量子點(diǎn)。這些含氮量子點(diǎn)由于表面存在活性的氨基，便于進(jìn)一步的表面修飾，且其熒光特性也與常見(jiàn)的碳量子點(diǎn)存在差異。Wang等[24]以三聚氰胺和丙三醇為原料在酸催化的條件下，通過(guò)熱解的方式制備了具有良好上轉(zhuǎn)換特性的含氮碳量子點(diǎn)。此外，Zhang[25]和Zhu等[26]以乙二胺為氮源，分別用丙烯酸和檸檬酸為碳源，通過(guò)微波合成的方法制備了含氮的碳量子點(diǎn)。

該文使用乙二胺為原料，通過(guò)電化學(xué)合成的方法，制備了含氮碳量子點(diǎn)，并將其應(yīng)用于Cu2+的熒光定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

無(wú)水乙二胺（H2NCH2CH2NH2）、二氯甲烷（CH2Cl2）、高氯酸鋰（LiClO4·3H2O）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，以上試劑均為分析純。

F-2700熒光分光光度計(jì)（Hitachi，日本），DZF-6050型真空干燥箱（上海華連醫(yī)療器械有限公司），Agilent 8453紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（AgilentTechnologies，美國(guó)），透射電子顯微鏡(TEM 2010，JEOL，日本)，pHS-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠),LA 410UV紫外光源（HAYASHI,日本），IKA磁力攪拌器（德國(guó)），IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)），傅立葉紅外光譜儀（AVATAR-370DTGS）。

1.2 含氮碳量子點(diǎn)的制備

首先用量筒量取無(wú)水乙二胺100 mL，在燒杯中加入高氯酸鋰（LiClO4·3H2O）1.6 g，慢慢攪拌溶解，然后通氮?dú)?0 min左右，再分別用直徑為0.5 cm的石墨棒做反應(yīng)的陰陽(yáng)極，通入直流電源，電流密度的控制范圍大約在20～100 mA/cm2。在反應(yīng)的過(guò)程中看到陰極周?chē)袣馀莓a(chǎn)生，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，溶液的顏色逐漸變化，由無(wú)色到淺黃色，最后到灰綠色。反應(yīng)一直在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行，反應(yīng)持續(xù)了大約4個(gè)小時(shí)左右。反應(yīng)結(jié)束后，用砂芯漏斗抽濾，抽濾后得到的溶液顏色是亮黃色的，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在65℃下旋干，然后用水溶解，用二氯甲烷萃取，得到粒徑大小均一的含氮碳量子點(diǎn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 含氮碳量子點(diǎn)的元素分析

表1給出了所合成的含氮碳量子點(diǎn)的元素分析結(jié)果，其元素含量為：C 53.03%，N 33.28%，H 5.44%，和O 8.25%（計(jì)算得出）。比較含氮碳量子點(diǎn)和原料乙二胺的元素分布可以看出含氮碳量子點(diǎn)的C/N比略高于乙二胺的C/N比，說(shuō)明量子點(diǎn)中的部分碳元素可能來(lái)自于石墨電極。

表1 含氮碳量子點(diǎn)的元素分析表Tab.1 Elemental analysis results of nitrogen-containing carbon quantum dots

2.2 含氮碳量子點(diǎn)的紅外光譜

圖1給出了分別以乙醇或乙二胺為原料制備含氮碳量子點(diǎn)的紅外譜圖。圖1（a）中峰值在～1 666 cm-1顯示的是C=O群的振動(dòng)峰存在，在～3 405 cm-1則顯示的是-OH峰，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明合成的碳量子點(diǎn)表面含有羧基（-COOH）與羥基（-OH）官能團(tuán)。圖1(b)顯示含氮碳量子點(diǎn)的紅外光譜，圖中峰值出現(xiàn)在～3 423 cm-1處的伸縮振動(dòng)峰為-NH的峰，在～1 475 cm-1的彎曲振動(dòng)峰顯示的是-NH的峰，由此說(shuō)明合成的含氮碳量子點(diǎn)含有-NH鍵。

2.3 含氮碳量子點(diǎn)的透射電鏡圖

圖2為含氮量子點(diǎn)的TEM圖與HR-TEM，TEM結(jié)果顯示制得的含氮碳量子點(diǎn)平均粒徑約為5 nm左右，與以乙醇為原料制得的碳量子點(diǎn)的平均粒徑相仿[17]

2.4 含氮碳量子點(diǎn)的紫外吸收光譜

圖1 （a）碳量子點(diǎn)，（b）含氮碳量子點(diǎn)的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of as-prepared CDs(a),(b)nitrogencontaining quantum dots

從圖3含氮碳量子點(diǎn)的紫外吸收光譜圖中，可以看出其紫外吸收光譜圖（a線）與碳量子點(diǎn)（以乙醇為原料制備，b線）相似，在200～300 nm左右有吸收。

2.5 含氮碳量子點(diǎn)的單光子激發(fā)熒光光譜

圖2 含氮量子點(diǎn)的TEM圖與HR-TEM圖Fig.2 TEM and HR-TEM images of the nitrogen-containing carbon quantum dots

圖4 含氮碳量子點(diǎn)的紫外吸收光譜Fig.4 One-photon luminescence spectra of the nitrogencontaining carbon quantum dots

圖4為不同激發(fā)波長(zhǎng)下（380 nm、400 nm、420 nm、440 nm、460 nm、480 nm、500 nm）含氮碳量子點(diǎn)的熒光光譜圖。由圖可知，在365 nm的紫外燈照射下，樣品發(fā)出明顯的藍(lán)光，并且熒光強(qiáng)度很強(qiáng)。隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增大，含氮碳量子點(diǎn)的發(fā)射光譜逐漸紅移，這可能是由于含氮碳量子點(diǎn)粒子間的不同表面狀態(tài)和不同粒徑大小差異所造成的[25]。

2.6 含氮碳量子點(diǎn)在雙光子激發(fā)下的熒光光譜

由圖5可知，含氮碳量子點(diǎn)在雙光子（λex=800 nm）激發(fā)下，在475 nm處有較強(qiáng)發(fā)射峰。這與其在400 nm光激發(fā)下的發(fā)射峰位置相近（圖4），說(shuō)明了含氮碳量子點(diǎn)也有雙光子發(fā)射的能力。

2.7 溶液pH對(duì)含氮碳量子點(diǎn)熒光的影響

圖5 含氮碳量子點(diǎn)在雙光子激發(fā)條件下熒光發(fā)射光譜圖Fig.5 Two-photon(800 nm excitation)luminescence spectra of the nitrogen-containing carbon quantum dots

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同pH值的溶液中，功能化碳量子點(diǎn)在400 nm光激發(fā)下的熒光響應(yīng)。圖6可以看出，其熒光強(qiáng)度在pH值為3.0～9.0的范圍內(nèi)沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明其具有較好熒光穩(wěn)定性。

圖6 含氮碳量子點(diǎn)在不同pH值條件下的熒光光譜圖Fig.6 Fluorescent responses of nitrogen-containing carbon quantum dots(0.02 mg/mL)in PBS buffer with pH ranging from 3.0 to 9.0.Excitation wavelength:400 nm

2.8 銅離子對(duì)含氮碳量子點(diǎn)的熒光淬滅作用及其測(cè)定

圖7 不同銅離子濃度存在時(shí)含氮碳量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜圖Fig.7 Left One-photon fluorescence spectra of nitrogen-containing quantum dots(0.02 mg/mL)upon the addition of different concentrations of Cu2+ions(0～300 μmol/L)in PBS(pH7.4).Excitation wavelength:400 nm.Right Plot of fluorescence intensity changes at 453 nm of nitrogen-containing quantum dots with the addition of Cu2+

圖7為含氮碳量子點(diǎn)對(duì)Cu2+離子濃度響應(yīng)的熒光發(fā)射光譜圖以及線性關(guān)系圖。從圖中可以看出，在激發(fā)波長(zhǎng)為400 nm條件下，隨著Cu2+離子濃度的增加，含氮碳量子點(diǎn)（0.02 mg/mL）熒光強(qiáng)度逐漸下降。在Cu2+離子濃度0.5～250 μmol/L范圍內(nèi)，453 nm處熒光發(fā)射峰強(qiáng)度與Cu2+離子濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，當(dāng)Cu2+離子濃度達(dá)到300 μmol/L后，體系熒光強(qiáng)度不再隨Cu2+離子濃度的增加而減小。含氮碳量子點(diǎn)與銅離子反應(yīng)后發(fā)生熒光猝滅機(jī)理，推測(cè)可能是由于其與銅離子絡(luò)合后，將有利于激發(fā)電子轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致其熒光被猝滅。

圖8 不同金屬離子對(duì)含氮碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響Fig.8 The influence of different metal ions on the fluorescent of nitrogen-containing carbon quantum dots

實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了其他常見(jiàn)金屬離子對(duì)含氮碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖8所示。其中含氮碳量子點(diǎn)濃度為0.02 mg/mL，加入的銅離子濃度為10 μmol/L，鈉離子、鉀離子濃度為銅離子的50倍，其他的金屬離子（鎂離子、鈣離子，亞鐵離子、鐵離子、鋅離子、鎳離子、鎘離子、鉛離子、鉻離子、鈷離子）為銅離子濃度的10倍。結(jié)果顯示除鎳離子外，這些金屬離子均不會(huì)對(duì)該實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生明顯的干擾，說(shuō)明了含氮碳量子點(diǎn)對(duì)銅離子的檢測(cè)具有較好的選擇性。

3 結(jié)論

以乙二胺為原料，應(yīng)用電化學(xué)方法成功合成了含氮碳量子點(diǎn)。該含氮碳量子點(diǎn)在pH=3～9的溶液中具有穩(wěn)定的熒光響應(yīng)，其他金屬離子對(duì)其干擾很小，因而可用于溶液中微量銅離子濃度的熒光定量分析。

[1]Baker S N,Baker G A.Luminescent Carbon Nanodots:emergent Nanolights.[J].Angewandte Chemie,International Edition,2010,49(38):6 726～6 744,S6 721～S6 726.

[2]Tang B,Xing Y,Li P,et al.A Rhodamine-Based Fluorescent Probe Containing a Se-N Bond for Detecting Thiols and Its Application in Living Cells[J].Journal of the American ChemicalSociety,2007,129(38):11 666～11 667.

[3]Koide Y,Urano Y,Kenmoku S,et al.Design and Synthesis of Fluorescent Probes for Selective Detection of Highly Reactive Oxygen Species in Mitochondria of Living Cells[J].Journal of the American Chemical Society,2007,129(34):10 324～10 325.

[4]Qian H,Dong C,Weng J,et al.Facile one-pot synthesis of luminescent,water-soluble,and biocompatible glutathione-coated CdTe nanocrystals[J].Small,2006,2(6):747～751.

[5]Cao Y,Banin U.Growth and Properties of Semiconductor Core/Shell Nanocrystals with InAs Cores[J].Journal of the American Chemical Society,2000,122(40):9 692～9 702.

[6]Madhankumar A B,Slagle-Webb B,Mintz A,et al.Interleukin-13 receptor-targeted nanovesicles are a potential therapy for glioblastoma multiforme[J].Molecular Cancer Therapeutics,2006,5(12):3 162～3 169.

[7]Resch-Genger U,Grabolle M,Cavaliere-Jaricot S,et al.Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels[J].Nature Methods,2008,5(9):763～775.

[8]孫寶全，徐詠藍(lán)，衣光舜，等.半導(dǎo)體納米晶體的光致發(fā)光特性及在生物材料熒光標(biāo)記中的應(yīng)用[J].分析化學(xué),2002,30(09):1 130～1 136.

[9]Yang S,Wang X,Wang H,et al.Carbon Dots as Nontoxic and High-Performance Fluorescence Imaging Agents[J].Journal of Physical Chemistry C,2009,113(42):18 110～18 114.

[10]Sun Y,Zhou B,Lin Y,et al.Quantum-Sized Carbon Dots for Bright and Colorful Photoluminescence[J].Journal of the American Chemical Society,2006,128(24):7 756～7 757.

[11]Sun Y,Wang X,Lu F,et al.Doped Carbon Nanoparticles as a New Platform for Highly Photoluminescent Dots[J].Journal of Physical Chemistry C,2008,112(47):18 295～18 298.

[12]Zhao Q,Zhang Z,Huang B,et al.Facile preparation of low cytotoxicity fluorescent carbon nanocrystals by electrooxidation of graphite[J].Chemical Communications(Cambridge,United Kingdom),2008,41:5 116～5 118.

[13]Cao L,Wang X,Meziani M J,et al.Carbon Dots for Multiphoton Bioimaging[J].Journal of the American Chemical Society,2007,129(37):11 318～11 319.

[14]Yang S,Cao L,Luo P G,et al.Carbon Dots for Optical Imaging in Vivo[J].Journal of the American Chemical Society,2009,131(32):11 308～11 309.

[15]Ray S C,Saha A,Jana N R,et al.Fluorescent Carbon Nanoparticles:Synthesis,Characterization,and Bioimaging Application[J].Journal of Physical Chemistry C,2009,113(43):18 546～18 551.

[16]齊寶平，龍艷敏，包蕾，等.電化學(xué)方法在熒光碳點(diǎn)研究中的應(yīng)用[J].電化學(xué),2011,17(03):271～277.

[17]Xu X,Ray R,Gu Y,et al.Electrophoretic Analysis and Purification of Fluorescent Single-Walled Carbon Nanotube Fragments[J].Journal of the American Chemical Society,2004,126(40):12 736～12 737.

[18]Li H,He X,Kang Z,et al.Water-soluble fluorescent carbon quantum dots and photocatalyst design[J].AngewandteChemie,InternationalEdition,2010,49(26):4 430～4 434,S4 430～S4 431.

[19]Zheng L,Chi Y,Dong Y,et al.Electrochemiluminescence of Water-Soluble Carbon Nanocrystals Released Electrochemically from Graphite[J].Journal of the American Chemical Society,2009,131(13):4 564～4 565.

[20]杜海軍.石墨烯和熒光碳納米顆粒的制備及其電化學(xué)特性的研究[D].華南理工大學(xué),2010.

[21]Li H,Ming H,Liu Y,et al.Fluorescent carbon nanoparticles:electrochemical synthesis and their pH sensitive photoluminescence properties[J].New Journal of Chemistry,2011,35(11):2 666～2 670.

[22]Song Y,Shi W,Chen W,et al.Fluorescent carbon nanodots conjugated with folic acid for distinguishing folatereceptor-positive cancer cells from normal cells[J].Journal of Materials Chemistry,2012,22(25):12 568～12 573.

[23]Liu C,Zhang P,Tian F,et al.One-step synthesis of surface passivated carbon nanodots by microwave assisted pyrolysis for enhanced multicolor photoluminescence and bioimaging[J].Journal of Materials Chemistry,2011,21(35):13 163～13 167.

[24]Wang C,Wu X,Li X,et al.Upconversion fluorescent carbon nanodots enriched with nitrogen for light harvesting[J].Journal of Materials Chemistry,2012,22(31):15 522～15 525.

[25]Zhang P,Li W,Zhai X,et al.A facile and versatile approach to biocompatible“fluorescent polymers”from polymerizable carbon nanodots[J].Chemical Communications(Cambridge,United Kingdom),2012,48(84):10 431～10 433.

[26]Zhu S,Meng Q,Wang L,et al.Highly Photoluminescent Carbon Dots for Multicolor Patterning,Sensors,and Bioimaging[J].Angewandte Chemie,International Edition,2013,52(14):3 953～3 957.