明膠納米銀的一鍋式合成及其高效催化性能的研究

孫宗招，李帥，張寧，董敏敏，馮路平，許玉嬌，王樺

(曲阜師范大學化學與化工學院，山東省生命有機分析重點實驗室,山東曲阜273165)

0 引言

由于過氧化物酶具有高效、專一的催化性能和溫和的反應條件[1]，一直被廣泛應用于多種有機底物的酶促反應體系和生化檢測領域[2]。然而，常見的蛋白類過氧化物酶，如辣根過氧化物酶（HRP），在生物標記和酶聯免疫分析過程中，存在易受外界環(huán)境條件的影響而失去活性問題，加之其昂貴的價格以及苛刻的儲存條件，大大限制了其在催化以及傳感檢測領域的廣泛應用。因此，尋找探索能夠替代蛋白酶的模擬酶和高效的酶促反應體系以拓展其潛在的應用前景仍然是當今酶催化反應領域的研究熱點[3～14]。

隨著納米技術的高速發(fā)展，納米材料在催化研究領域的應用取得了一系列的研究成果[3～4]。許多具有類過氧化物酶活性的納米粒子不僅擁有納米小尺寸效應，巨大比表面積，表面活性中心多等諸多特性，而且具有極強的酶催化反應活性與催化效率。例如，中科院生物物理研究所閻錫蘊研究小組首次報道了具有內在過氧化物模擬酶活性的磁性氧化鐵納米粒子[5]。其后，各種各樣類酶催化活性的納米功能材料的研究雨后春筍般涌現，包括：碳納米管[6],碳點[7],氧化石墨烯[8],雙金屬合金納米結構材料[9],二氧化鈰納米粒子[10],片狀和球狀FeS納米結構材料[11],小尺寸金納米粒子[12]，血紅素-石墨烯雜交納米復合物[13]，以及牛血清白蛋白穩(wěn)定化的金納米簇[14]等。這些類過氧化物酶不僅制備簡單、廉價、穩(wěn)定性高，而且具有抗變性和酶解特性，使其在酶催化應用中比天然酶更具優(yōu)勢。

明膠是一種最常用的天然生物高分子，主要成分是膠原蛋白,已廣泛應用于食品和藥品[15～16]。明膠具有可生物降解、無毒、和高生物相容性，特別是具有獨特的溶膠-凝膠轉換（臨界轉換溫度35℃）特性。以明膠作為穩(wěn)定劑和保護劑合成納米顆粒已有報道[17～19]。例如，Oluwatobi等[17]和Mahmoud等[18]分別利用明膠結合麥芽糖和檸檬酸鈉合成了小粒徑的納米銀。Kim研究組[19]結合電漿過程合成了抗白念珠菌的明膠納米銀。然而，這些方法大多需另加入還原劑，同時所合成的納米銀均未提及具有類過氧化物酶的催化特性。

研究工作以明膠為穩(wěn)定劑和還原劑，直接一鍋式反應合成了具有過氧化物酶催化活性和高儲藏穩(wěn)定性的明膠納米銀。該納米銀模擬酶能在常溫下處于凝固狀態(tài)，可克服常規(guī)銀合成法中存在的納米銀顆粒物催化活性以及穩(wěn)定性差等難題。同時，通過應用于常見酶促反應體系系統(tǒng)地考察了其過氧化物酶催化性能，并測定了其催化反應動力學米氏常數，為納米銀模擬酶的催化應用提供了新的理論依據。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市科瑞儀器有限公司），FA2004N電子分析天平（上海菁海儀器有限公司），Infinite M 200 PRO酶標儀（瑞士TECAN公司），UV-3600紫外可見光分析儀（日本島津公司）。

明膠，硝酸銀（AgNO3），3，3’，5，5’四甲基聯苯胺（TMB）,二甲基亞砜（DMSO）,檸檬酸（C6H8O7）,十二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·12H2O）,過氧化氫（H2O2）均購自Sigma公司；實驗過程中使用的其它試劑均為分析純，所用水均為二次蒸餾水。

1.2 納米銀的制備

一定量的AgNO3溶液與不同濃度的明膠水溶液混合，37℃下溫育攪拌并避光反應8 h。反應結束后進行產物分離純化，于4℃冰箱或常溫下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 納米銀的過氧化物酶活性的測試

不同條件下制備的一定量（例如，72 μmol/L）納米銀加入到按一定比例配置的不同濃度的TMB和H2O2酶促反應混合液中，于室溫下反應不同時間（例如，20 min），然后在波長652 nm處測量其相應吸光度值。

2 結果與討論

為探究合成明膠納米銀的最適反應條件，該實驗分別考察了不同硝酸銀的用量，明膠的用量，反應溫度，反應pH值以及反應時間的影響，通過將各種納米銀產物應用于TMB-H2O2酶促反應體系并測定其催化產物的吸光度值，系統(tǒng)地研究了納米銀最優(yōu)的合成反應條件。

2.1 不同明膠用量對合成納米銀的影響

采用固定量的AgNO3（20 mmol/L，0.2 mL）分別與不同質量分數（1%，2%，3%，4%，5%）明膠進行反應，并測定了合成的納米銀產物的UV光譜，結果如圖1所示。由此可知，以不同濃度明膠合成的納米銀的最大UV吸收峰的位置基本一致（450 nm），表明制得的納米銀顆粒尺寸大小相近，但以4%明膠合成的納米銀其UV吸收峰值最大，即反應獲得的納米銀的產率最高。此外，將所合成的納米銀分別用于TMB-H2O2酶促反應體系，并測量催化反應產物的吸光度值（圖2），結果表明，以4%明膠用量合成的納米銀催化產物的吸光度值最大，證明其催化H2O2氧化TMB的能力最大。因此，納米銀合成反應中最佳明膠的用量為4%。

2.2 不同的AgNO3用量對合成納米銀的影響

圖1 不同用量的明膠合成的納米銀的紫外可見光譜反應條件：20 mmol/L AgNO3分別與1%，2%，3%，4%，5%明膠混合，于37℃下溫育攪拌，避光反應8 hFig.1 UV-vis spectraums of silver nanoparticles synthesised by different dosage of gelatin Reaction conditions:AgNO3(20 mmol/L)to be sepatrately mixed with 1%，2%，3%，4%，5%gelatin,incubated and stirred for 8 h at 37℃under the light-shaded condition

圖2 不同的明膠用量合成的納米銀的催化性能反應條件：72 μmol/L不同納米銀，4.0×10-4mol/L TMB和9.0 mmol/L H2O2，室溫下反應20 minFig.2 The catalytic activities of silver nanoparticles synthesised by different dosage of gelatin.(Inset shows the color changes of TMB-H2O2reactions catalyzed by silver nanoparticles)Reaction conditions:72 μmol/L silver nanoparticles,4.0×10-4mol/L TMB,9.0mmol/L H2O2,mixed at room temperature for 20 min

實驗采用固定量的4%明膠與不同量的AgNO3反應，并對獲得的納米銀產物進行UV光譜分析（圖3）和催化反應產物的檢測（圖4）。首先，由圖3可知，以不同濃度AgNO3合成的納米銀其UV吸收峰的形狀以及最大吸收峰的位置與面積有一定差別，反映對應的納米銀顆粒的大小、形成量和光學性質的差異性，其中，以6.67 mmol/L AgNO3合成的納米銀的UV吸收峰面積較大，而以5.71 mmol/L AgNO3制備的納米銀的吸收峰最高。其次，由圖4可知，不同條件下合成的納米銀對TMB-H2O2體系的催化反應能力的差別也較大，當AgNO3的使用濃度達5.71 mmol/L后，其催化能力趨于最大，繼續(xù)增加AgNO3的使用濃度，產物對TMB-H2O2體系催化反應的能力變化不大。鑒此，實驗選擇5.71 mmol/L AgNO3為合成納米銀的最優(yōu)濃度。

圖3 不同用量AgNO3合成的納米銀的紫外可見光譜反應條件：4%明膠分別與1.82 mmol/L，3.33 mmol/L，4.62 mmol/L，5.71 mmol/L，6.67mmol/L，7.50 mmol/L AgNO3混合，于37℃下溫育攪拌并避光反應8 hFig.3 UV-vis spectraums of silver nanoparticles synthesized by different dosage of AgNO3 Reaction conditions:4%gelatin separately mixed with 1.82 mmol/L,3.33 mmol/L,4.62 mmol/L,5.71 mmol/L,6.67 mmol/L and 7.50 mmol/L AgNO3,incubated and stirred for 8 h.at 37℃under the light-shaded condition

圖4 不同AgNO3用量合成的納米銀的催化性能反應條件：同圖2Fig.4 The catalytic activities of silver nanoparticles synthesised by different dosage of AgNO3.(Inset shows the color changes of TMB-H2O2reactions catalyzed by silvernanoparticles)Reaction conditions:the same as in Fig.2

2.3 其它反應條件（溫度、pH、時間）對合成納米銀的影響

圖5 不同溫度下合成的納米銀的催化性能反應條件：合成時，4%明膠與5.71 mmol/L AgNO3混合，于不同溫度（4℃，25℃，37℃，65℃）下溫育攪拌并避光反應8 h；催化反應條件同圖2Fig.5 The catalytic activities of silver nanoparticles synthesised under different temperatures Reaction conditions:4%gelatin mixed with 5.71 mmol/L AgNO3,incubated at different temperature(4℃,25℃,37℃,65℃)under the light-protected condition and stired for 8 h;the catalytic reaction conditions as in Fig.2

實驗考察了溫度、pH、時間等反應條件對合成納米銀的影響。首先，采用在不同溫度（4℃,25℃,37℃,65℃）下反應合成納米銀，并考察了其對TMB-H2O2體系的催化能力，結果如圖5所示。由圖5可知，納米銀的最佳合成反應溫度以37℃最佳并與人生理體溫一致。其次，實驗研究了在不同pH下合成的納米銀對TMB-H2O2體系的催化反應情況（圖6），結果表明，以中性或弱酸/弱堿的反應條件較優(yōu)。最后，實驗進一步考察了不同的反應時間對合成納米銀的影響。圖7顯示了制得的納米銀對TMB-H2O2催化反應體系催化結果，由此可知，合成反應進行8 h后合成反應即可完成，所得到的納米銀產物的催化效率達到最大化。

綜上所述，根據酶催化效率最大化的標準，合成明膠納米銀的最優(yōu)反應條件為：4%明膠，5.71 mmol/L AgNO3，于中性或弱酸弱堿條件下，在37℃避光反應8 h。

2.4 納米銀的儲藏穩(wěn)定性考察

圖6 不同pH值下合成的納米銀的催化性能反應條件：合成時，4%明膠與5.71 mmol/LAgNO3混合，于37℃和不同pH值（2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0）下溫育攪拌并避光反應8 h；催化反應條件同圖2Fig.6 The catalytic activities of silver nanoparticles synthesised at different pH values Reaction conditions:4%gelatin mixed with 5.71 mmol/L AgNO3,incubated at 37℃and different pH values(2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0);the catalytic reaction conditions as in Fig.2

圖7 不同反應時間下合成的納米銀的催化性能反應條件：合成時，4%明膠與5.71 mmol/L AgNO3混合，于37℃和pH7.0以及不同反應時間（4，6，8，10，12 h）下溫育攪拌并避光反應8 h；催化反應條件同圖2Fig.7 The catalytic activities of silver nanoparticles synthesised at different reaction time Reaction conditions:4%gelatin mixed with 5.71 mmol/L AgNO3,incubated at 37℃,pH7.0 and different time(4,6,8,10,12 h);the catalytic reaction conditions as in Fig.2

目前，蛋白類過氧化物酶雖然催化活性高，但易于受環(huán)境條件干擾而失活。此外，常見方法合成的納米銀尚存在穩(wěn)定性較差的問題。該文考察了所制得的納米銀的穩(wěn)定性。將納米銀置放于室溫或4℃冰箱避光保存，每隔一段時間（2個月）取出一定量納米銀，并采用TMB-H2O2酶促反應體系考察其催化活性，結果如圖8所示。由此可知，納米銀經儲藏12個月，其催化活性仍變化不大，呈現極高的穩(wěn)定性。

圖8 明膠納米銀催化活性的穩(wěn)定性反應條件：72 μmol/L納米銀（每隔2個月取出）,其它條件同圖2Fig.8 The catalytic activities of silver nanoparticles stored at different months Reaction conditions:72 μmol/L silver nanoparticles（taken out every two months）,the rest as in Fig.2

眾所周知，酶催化反應的表觀穩(wěn)態(tài)常數Km值是酶的特征性常數，只與酶的性質、酶所催化的底物和酶促反應條件(如溫度、pH、有無抑制劑等)有關，而與酶的濃度無關。一般地，催化反應的Km值愈大，酶與底物的親和力愈小，反之則親和力愈大，而酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達到最大反應速度[20]。為了更進一步闡明該納米銀模擬酶的催化性能和反應動力學，研究了納米銀模擬酶對催化反應底物的表觀穩(wěn)態(tài)動力學，并采用米氏方程的雙倒數作圖法，對其Km值進行了測定分析（即Lineweaver-Burk plot，也可稱為雙倒數方程）。將1／V對l／[c]作圖得到一條直線，該直線在Y軸的截距即為1／Vmax，在X軸上的截距即為1／Km的絕對值[21]。其中V是反應速率，c是底物濃度。由此獲得的測定結果如圖9所示。

圖9 明膠納米銀的催化反應動力學的考察(a)TMB；(b)H2O2Fig.9 Investigation of Michaelis reaction dynamics of(a)TMB and(b)H2O2catalysized by silver nanoparticles

根據圖9求得的納米銀模擬酶對各底物的Km值，發(fā)現當以H2O2為底物時，納米銀對應的Km為50.12 mmol/L，而以TMB為底物時，納米銀對應的Km為0.15 mmol/L。將之與文獻[5]中HRP對H2O2的Km值（3.7 mmol/L)和TMB的Km值（0.43 mmol/L)作比較，發(fā)現納米銀對H2O2底物Km比HRP的高，表明需要較高濃度H2O2以獲得最大反應速度；而納米銀對TMB底物的對應Km比文獻[5]報道的HRP的要低，表明相對于HRP該納米銀對底物TMB具有更高的親和力，即需要較低的TMB濃度以達到最大反應速度。以上結果表明，該明膠納米銀具有與常規(guī)過氧化物酶（如HRP）相比擬的催化性能。

3 結論

該文利用明膠的穩(wěn)定性和還原性、特別是其獨特的溶膠-凝膠的轉換（溫度35℃）特性，發(fā)展了綠色的一鍋式反應合成具有類過氧化物酶催化性能的納米銀模擬酶。通過采用TMB-H2O2體系對其反應催化底物的動力學米氏常數的測定，表明了納米銀在過氧化氫檢測方面較常見蛋白酶（如HRP）的優(yōu)越性。此外，由于明膠常溫下處于凝固態(tài)，大于35℃才溶解成溶膠的奇異特性，使得制備的納米銀模擬酶具有更好的穩(wěn)定性（如便于保存，不易變質等）。最重要的是，由于明膠外殼含有較多的羧基和氨基等功能基團，不僅可提高納米銀的生物親和性，而且便于通過這些功能團進行各種化學修飾，從而使其在酶催化體系以及酶傳感檢測分析方面具有非常廣泛的應用前景。

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