建立腦雙位點微透析結(jié)合高效液相色譜-柱后固定化酶反應(yīng)器-電化學(xué)方法同步監(jiān)測大鼠腹內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)和海馬中乙酰膽堿和膽堿含量

張美玉，蔡鐵全，孫丹丹，劉 洋，崔 悅，王丹巧

（1．中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700；2．國家食品藥品監(jiān)督管理總局保健食品審評中心，北京100070）

建立腦雙位點微透析結(jié)合高效液相色譜-柱后固定化酶反應(yīng)器-電化學(xué)方法同步監(jiān)測大鼠腹內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)和海馬中乙酰膽堿和膽堿含量

張美玉1，蔡鐵全2，孫丹丹1，劉 洋1，崔 悅1，王丹巧1

（1．中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700；2．國家食品藥品監(jiān)督管理總局保健食品審評中心，北京100070）

目的建立同步動態(tài)監(jiān)測清醒自由活動狀態(tài)下大鼠腹內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（m PFC）和海馬細胞外液中乙酰膽堿（ACh）和膽堿（Ch）方法，用于藥物干預(yù)下不同腦區(qū)膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)變化研究。方法建立m PFC和海馬雙位點雙通道同步微透析采樣技術(shù)和高效液相色譜-柱后固定化酶反應(yīng)器-電化學(xué)（HPLCIMER-ECD）方法。通過對清醒自由活動大鼠m PFC和海馬同步灌流透析取樣，HPLC-IMER-ECD分析藥物作用下大鼠mPFC和海馬細胞外液中ACh和Ch的動態(tài)變化，驗證該技術(shù)方法的可行性和適用性。結(jié)果大鼠m PFC和海馬雙套管植入術(shù)及透析采樣后狀態(tài)表現(xiàn)良好，表明腦雙位點雙通道同步微透析采樣技術(shù)可行。HPLC-IMER-ECD法測定ACh和Ch，兩者濃度在0．02～2．00μm o l·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，ACh最低檢測限為10 nm o l·L－1，Ch最低檢測限為5 nm o l·L－1（信噪比為3∶1）。ACh 0．1，0．4和2．0μm o l·L－1日內(nèi)精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0．87%～1．83%，日間精密度為5．38%～6．80%；Ch日內(nèi)精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1．60%～2．91%，日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5．56%～7．38%；ACh相對回收率為96．0%～113．0%，Ch為102．3%～109．2%。疊氮鈉能明顯降低m PFC和海馬細胞外液中ACh（P＜0．05），但能顯著升高兩腦區(qū)內(nèi)Ch含量（P＜0．05）。人參皂苷Rg1可逆轉(zhuǎn)疊氮鈉導(dǎo)致的海馬區(qū)ACh降低（P＜0．05）及m PFC和海馬區(qū)Ch含量的升高（P＜0．05）。m PFC細胞外液中ACh和Ch較高，受到疊氮鈉影響較海馬區(qū)更敏感。結(jié)論腦雙位點微透析結(jié)合HPLC-IMER-ECD方法能同步監(jiān)測大鼠m PFC和海馬中ACh和Ch含量變化。人參皂苷Rg1可通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)ACh和Ch動態(tài)平衡，增強中樞膽堿能系統(tǒng)的功能。

腦雙位點微透析；高效液相色譜法；固定化酶反應(yīng)器；電化學(xué)；乙酰膽堿；膽堿

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．015

腦內(nèi)微透析（brain microdialysis，BMD）技術(shù)是一種對麻醉或清醒自由活動動物腦內(nèi)取樣的新手段，它的出現(xiàn)為腦內(nèi)細胞外環(huán)境進行在體采樣和動態(tài)監(jiān)測提供了方便。以往報道顯示，腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)變化的研究方法多采用單位點單通道BMD采樣，而多位點多通道BMD的開發(fā)和應(yīng)用卻很少涉及［1］。因此，本研究室近期開展了腦雙位點雙通道同步微透析采樣技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜-柱后固定化酶反應(yīng)器-電化學(xué)（high performance liquid chromatography with post column immobilized enzyme reactor electrochemical detection，HPLC-IMERECD）分析方法，對大鼠腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)主要投射區(qū)域腹內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（medial prefrontal cortex，m PFC）和海馬細胞外液中乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）和膽堿（choline，Ch）進行動態(tài)監(jiān)測和對比分析，比較不同神經(jīng)核團內(nèi)膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。同時采用特異性呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ抑制劑疊氮鈉（NaN3）對大鼠m PFC和海馬同步灌流，造成膽堿能神經(jīng)投射區(qū)域線粒體損傷和膽堿類遞質(zhì)代謝異常，建立一種相對簡單、快速并適宜微透析動態(tài)監(jiān)測的急性阿爾茨海默癥大鼠模型，觀察人參皂苷Rg1對該模型的m PFC和海馬細胞外液中膽堿類遞質(zhì)的影響，為篩選中藥腦保護劑提供方法學(xué)參考和藥理學(xué)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

SD大鼠18只，雄性，體質(zhì)量250～300 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（京）2012-0001。每一塑料籠（長35 cm，寬47 cm，高20 cm）飼養(yǎng)大鼠3～5只，自由進食飲水。實驗室環(huán)境溫度（16～20）℃，相對濕度為40%～55%，12 h光照周期（7：00～19：00照明）。

1．2 藥品和試劑

人參皂苷Rg1，批號為MUST-11041201，四川成都生物制品檢定所生產(chǎn)；氯化ACh、氯化Ch、甲硫酸新斯的明（neostigmine methylsulfate）、氯化鉀和HPLC級防腐劑ProC lin95均購自Sigm a公司。NaN3，Merck公司產(chǎn)品。乙腈和甲醇為Fisher Chem ica ls公司產(chǎn)品。水合三氯乙醛、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉和EDTA-Na2均為分析純級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1．3 儀器設(shè)備

液相檢測系統(tǒng)包括高效液相色譜、Antec DecadeⅡSDC電化學(xué)檢測器、鉑金工作電極、銀／氯化銀參比電極和Clarity Lite色譜工作站，荷蘭Antecleyden公司出產(chǎn)。微柱ACh／Ch分析柱（165G-007A，530 mm×1 mm）和AChE／ChOX×IMER（191-H03，50 mm×1 mm），均由美國BASi公司提供。SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ-1000超聲波清洗器，昆山超聲波儀器有限公司；德國Sartorius arium 61316反滲透純水系統(tǒng)；天津津騰水相和有機相微孔濾膜。

立體定位儀STRONG8003、動物體溫維持儀-69001和手持式顱鉆／90-102，購自深圳瑞沃德公司。玻璃離子體水泥（水門?。?，上海醫(yī)療器械股份有限公司齒科材料廠。微透析系統(tǒng)包括CMA／12 MD Elite探針（膜長：4 mm，膜直徑：0．5 mm，截留量：20 kU／膜長：2 mm，膜直徑0．5 mm，截留量：20 kU）及探針套管、CMA／402微量注射泵和CMA／470低溫樣品自動收集器，均購自瑞典CMA Microd AB公司；五通轉(zhuǎn)環(huán)清醒活動裝置，美國InsteCh公司。

1．4 動物分組和給藥

大鼠自由進食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機分為正常對照組、模型組和人參皂苷Rg1組，每組6只。人參皂苷Rg1組大鼠腦套管植入術(shù)前7 d連續(xù)ip給藥20 m g·kg－1，每天1次，給藥體積為4 m L·kg－1。

1．5 大鼠腦雙位點同步微透析采樣

1．5．1 大鼠m PFC和海馬雙位點套管植入術(shù)

大鼠ip給予水合氯醛350 m g·kg－1麻醉。頭部剃毛并清理干凈，固定于立體定位儀，顱腦處于水平位，再用眼眶固定桿固定大鼠的框下緣。顱骨表面暴露大小約20 mm×20 mm。參照Paxinos等［2］編寫的大鼠立體定位圖譜，以前囟（bregma）為坐標(biāo)原點，在腦m PFC（前：3．2 mm，右：1．5 mm，深：2．0 mm，與矢狀面成10°的夾角）和海馬（后：5．6 mm，左：4．6 mm，深：3．4 mm）處用手持式顱鉆打孔。在與此定位點成三角形、距離4～7 mm的恰當(dāng)位置再選取2個位點，作為固定小螺釘?shù)拇蚩缀椭踩朦c。之后用彎鑷和螺絲刀相互配合，把2個小螺釘分別擰緊并固定于顱骨表面。接著在套管植入點處暴露硬腦膜，用注射針頭輕輕挑起硬腦膜，暴露腦表面。調(diào)整定位儀的立體臂，從套管尖端接觸腦表面開始計數(shù)，并緩慢旋轉(zhuǎn)插入至設(shè)定深度。調(diào)好玻璃離子體水泥的黏稠度，先固定大腦左半球后方海馬套管，然后再固定右半球右上方m PFC處的套管。用配套的堵頭將套管封口。術(shù)后ip給予慶大霉素（40 mg·kg－1）一次，在室溫條件下恢復(fù)1 d，觀察大鼠是否有死亡，行動與飲食異常，是否有無萎靡不振等現(xiàn)象。

1．5．2 配置改良的林格氏液

對灌流液的組成及配比［3］進行了調(diào)整，故命名為改良的林格（Ringer）液（N-Ringer），其組成為（mmo l·L－1）：NaCl 125．0，KCl 2．7，CaCl21．2，MgC l21．0，NaHCO323．0，Na2HPO44．3和KH2PO41．5。用18．2Ω去離子水溶解，混勻，用HC l調(diào)節(jié)pH值為7．4，0．22μm微孔濾膜過濾，4℃保存在冰箱中待用。

1．5．3 大鼠腦雙位點雙通道同步透析采樣

術(shù)后次日從8：00～20：00進行透析實驗。大鼠在清醒狀態(tài)下插入探針，其中將膜長2 mm探針插入m PFC位點套管中，將4 mm探針插入于海馬套管中。用膠布固定好兩個探針，將大鼠放在清醒活動裝置（33 cm×40 cm×36 cm）內(nèi)讓其自由活動。兩條通路均用改良的N-Ringer（含新斯的明2μmol·L－1）同步灌流透析，每個通道流速均為1．5μL·m in－1。平衡1 h后，開始收集透析液，每20 m in收集1管（樣品體積為30μL）。其中正常對照組用N-Ringer灌流，共收集540 m in。模型組和Rg1組用N-Ringer灌流平衡后，先收集透析液4管，作為基礎(chǔ)水平值。再用含NaN3的N-Ringer（含NaN350μm ol·L－1和新斯的明2μmo l·L－1，NaN3-N-Ringer）灌流120 m in造成腦線粒體損傷的急性AD模型，然后再換為N-Ringer灌流340 m in。Rg1組大鼠在NaN3-N-Ringer灌流結(jié)束同時，ip給予Rg1 20 mg·kg－11次，之后連續(xù)收集340 m in（圖1）。透析結(jié)束后大鼠給予麻醉劑量的水合氯醛350 m g·kg－1，處死大鼠，剝離大腦半球，置于10%甲醛固定液中，HE染色固定切片，鏡下觀察探針植入位置、深度及腦組織損傷情況。

1．5．4 體外回收率測定

不同膜長探針在使用前分別放置于ACh／Ch混標(biāo)液（1．00μmol·L－1）中，室溫為37℃，用N-Ringer以1．5μL·m in－1灌流，平衡30 m in后，開始收集透析液，每20 m in為1管，共4管。ACh（或Ch）探針體外回收率（%）＝（透析液的濃度均值／標(biāo)準(zhǔn)放置液中的濃度均值）×100%，用來折算腦微透析液中ACh和Ch的濃度。

1．6 HPLC-lMER-ECD分析ACh和Ch的方法1．6．1 色譜條件

等梯度洗脫的流動相組成為：50 mmol·L－1的NaH2PO4·2H2O，0．5 mmol·L－1的Na2·EDTA·2H2O，2 mmol·L－1的KCl，ProClin防腐劑1 m L·L－1，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8．3，用0．22μm膜過濾。流速為0．13 mL·m in－1。參考電極的電位設(shè)置為＋310 mV。柱溫和電極工作室溫為37℃，進樣量為20μL。

1．6．2 配置ACh和Ch標(biāo)準(zhǔn)原液和ACh／Ch混標(biāo)應(yīng)用液

精確稱取氯化ACh 18．15 mg，氯化Ch 13．95 mg，分別溶于50．00 m L乙酸標(biāo)準(zhǔn)稀釋液中，配制ACh和Ch標(biāo)準(zhǔn)原液（2．00 mm ol·L－1）。再分別吸取1．00 m L的ACh和Ch標(biāo)準(zhǔn)原液稀釋到100．00 m L，制成各自的標(biāo)準(zhǔn)儲備液（20．00μmol·L－1）。ACh和Ch標(biāo)準(zhǔn)儲備液各取10．00 m L進行混合，制成ACh／Ch混標(biāo)應(yīng)用液（10．00μm ol·L－1）。

1．6．3 方法專屬性考察

精確加入乙酸標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，將ACh／Ch混標(biāo)應(yīng)用液（10．00μmol·L－1）逐級稀釋為1．00μmol·L－1，也將ACh和Ch的單標(biāo)儲備液稀釋成濃度為1．00μm o l·L－1。以乙酸標(biāo)準(zhǔn)稀釋液為對照進樣，然后再分別將ACh和Ch的單標(biāo)、混標(biāo)應(yīng)用液連續(xù)5次進樣測定。

1．6．4 線性關(guān)系

精確加入乙酸標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，將ACh／Ch混標(biāo)應(yīng)用液（10．00μm ol·L－1）逐級稀釋成以下濃度：2．00，1．00，0．40，0．20，0．10，0．04和0．02μmol·L－1，每個濃度連續(xù)進樣5次，進行7個濃度分析，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線以樣品濃度（X）和峰面積（Y）做線性回歸，得到ACh和Ch標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．6．5 精密度

ACh／Ch混標(biāo)稀釋液0．10，0．40和2．00μmol·L－1，每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液于1 d內(nèi)重復(fù)測定5次，按照樣品濃度的相應(yīng)峰面積計算日內(nèi)精密度；同法連續(xù)測定5 d，計算日間精密度。

1．6．6 相對回收率

ACh／Ch混標(biāo)稀釋液0．10，0．40和2．00μmol·L－1分別連續(xù)進樣5次，以實測的濃度（由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品的濃度）與ACh（或Ch）標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之比來計算相對回收率。

1．6．7 穩(wěn)定性

標(biāo)準(zhǔn)溶液4℃冷藏放置穩(wěn)定性考察：ACh／Ch混標(biāo)稀釋液0．04，0．20和1．00μmol·L－1分別在4℃冷藏放置6，12和24 h，以即刻（0 h）作為對照，每個濃度連續(xù)進樣3次。測定各濃度ACh和Ch的峰面積，將測定的結(jié)果進行比較。

標(biāo)準(zhǔn)溶液25℃室溫放置穩(wěn)定性考察：上述3個濃度ACh／Ch混標(biāo)稀釋液置于25℃室溫放置3，6和12 h后進行測定，與即刻（0h）的樣品檢測結(jié)果進行對照，測定各濃度ACh和Ch的峰面積，并用面積衰減百分率（AD%）來表示ACh和Ch的穩(wěn)定性。

Fig．1 Sampling procedures of brain microdialysis．After a stabilization period of1 h，dual dialysis probes were perfused synchronously at a rate of 1．5μL·m in－1with Ringer′s solution containing neostigmine methylsulfate 2μmol·L－1（N-Ringer）．Baseline dialysate samples were collected for 80 m in．Rats in model group（M）or Rg1 group were perfused with modified Ringer＇s solution（containing NaN350μmol·L－1in N-Ringer，NaN3-N-Ringer）for 120 m in in the course of modeling and then switched back to N-Ringer to get perfused．Dialysate samples were taken continuously 340 m in during administration．Rats of Rg1 group were ip given Rg1 20 m g·kg－1while perfusion with NaN3-N-Ringer ended．NC：normal control group．

1．7 HPLC-lMER-ECD檢測透析液中ACh和Ch含量

分別對兩腦區(qū)收集結(jié)束時間點為20，60，100，140，180，220，260，300，340，380，420，460，500和540 m in的透析液進行測定。通過探針體外回收率折算兩腦區(qū)內(nèi)不同時間點含量。

1．8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 成功建立大鼠腦雙位點同步微透析采樣技術(shù)

為了驗證探針進入位置，對腦組織進行HE染色和切片。所有探針確定放置在m PFC和海馬的邊緣。探針植入mPFC的前額葉皮質(zhì)和扣帶回皮質(zhì)，植入海馬區(qū)探針占用CA1，CA2和CA3區(qū)域（圖2）。腦切片鏡下觀察到探針植入點見大量炎癥細胞聚集，也存在少量紅細胞（圖3）。把握定位的技術(shù)關(guān)鍵，能夠準(zhǔn)確地進行大鼠腦雙位點的套管植入術(shù)和同步透析取樣（圖4）。術(shù)中及術(shù)后未見大鼠死亡和異常行為，術(shù)后24 h狀態(tài)良好?？刂拼笫箢^頸部并對其安撫，清醒狀態(tài)下快速插入探針大鼠反應(yīng)不強烈。雙通道同步低流速灌流12 h及灌流后未見大鼠異常，采樣順利完成。

Fig．2 lllustration of microdialysis p robe targets in medial prefrontal cortex（m PFC）and hippocampus（Hip）．Probes（grey area indicates probe m embrane，black area indicates probe shaft）in m PFC occupied prelimbic and cingulate cortex，and those in Hip occupied the CA1，CA2，and CA3 sub-regions of the hippocampal formation．

Fig．3 lmplantation position of probes in to m PFC（A）and Hip（B）（HE×400）．The black arrows are the positions of implantation of the probe．There are a large number of lymphocytes in the area implanted into by probes，and a small amount of red cells in m PFC．

Fig．4 Dual-probe synchronous microdialysis in mPFC and Hip of rats．

2．2 HPLC-lMER-ECD分析ACh和Ch方法

2．2．1 方法的專屬性

乙酸標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的色譜圖上未見有峰（圖5），而ACh／Ch混標(biāo)稀釋液色譜圖上出現(xiàn)2個峰（圖6），結(jié)合單標(biāo)測定結(jié)果，ACh和Ch峰的保留時間分別是8．03和9．88 m in，說明本方法具有較好的專屬性。并且采用此方法對正常對照組m PFC和海馬透析液也進行了檢測（圖7）。

2．2．2 線性關(guān)系和最低檢測限

ACh的回歸方程為Y＝244．24X＋27．58（R2＝0．9943）；Ch的回歸方程為Y＝268．04X＋50．303（R2＝0．9950）。結(jié)果表明，ACh和Ch濃度在0．02～2．00μm o l·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖8）。以信噪比為3∶1計，ACh最低檢測限為10 nm o l·L－1，Ch最低檢測限為5 nmo l·L－1。通過多次反復(fù)進樣，結(jié)果具有一致性。

2．2．3 精密度

ACh日內(nèi)精密度良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均在0．87%～1．83%，日間精密度在5．38%～6．80%。3個濃度Ch日內(nèi)精密度RSD為1．60%～2．91%，日間精密度RSD在5．56%～7．38%（表1）。

Fig．5 Chromatogram of acetic acid standard diluent by high performance liquid chromatography with post column immobilized enzyme reactor electrochemical detection（HPLC-lMER-ECD）．

Fig．6 Ch rom atog ram of acety lcho line（ACh）and cho line（Ch）by HPLC-lMER-ECD．

Fig．7 Chromatograms of ACh and Ch in microdialysates from mPFC and Hip of normal rats by HPLC-lMER-ECD．

Fig．8 Linear curves of ACh（A）and Ch（B）detected by HPLC-lMER-ECD．

Tab．1 lntra-day and in ter-day precision for ACh and Ch peak areas for assay by HPLC-lMER-ECD

2．2．4 相對回收率

ACh 0．1，0．4和2．0μmol·L－13個濃度的相對回收率分別為（96．0±1．1）%，（113．0±2．6）%和（102．2±1．5）%；Ch 0．1，0．4和2．0μmol·L－13個濃度的相對回收率分別為（107．3±8．6）%，（109．2± 3．8）%和（102．3±1．8）%（表2）。

2．2．5 穩(wěn)定性

ACh／Ch混標(biāo)稀釋液0．04，0．20和1．00μm o l·L－1在4℃冷藏放置6 h，其衰減量最大，但放置時間延長至24 h，其衰減基本保持不變。同樣，在25℃室溫條件下放置6～12 h，Ach和Ch衰減量達到原濃度的30%（表3和表4）。The standard solutions of ACh and Ch 0．04，0．20 and 1．00μmol·L－1were placed at4℃for different time points．Area degradation percentage（%）＝（peak area of p laced specific tim e－peak area of0 h）（nA）／peak area of0 h（nA）×100%，which represented the stability of ACh and Ch．，n＝3．

Tab．2 Relative recovery of concentration of ACh and Ch by HPLC-lMER-ECD

Tab．3 Stability test of ACh and Ch by HPLC-lMER-ECD placed at 4℃for different time points

Tab．4 Stability test of ACh and Ch by HPLC-lMER-ECD placed at 25℃for different time points

2．3 人參皂苷Rg1對大鼠m PFC和海馬透析液中ACh和Ch含量的影響

2．3．1 正常組m PFC和海馬細胞外液中ACh的含量

大鼠m PFC細胞外液中ACh含量在100～140 m in明顯高于海馬（P＜0．05）。m PFC細胞外液中ACh含量在260 m in和420～500 m in明顯低于20 m in（P＜0．05）。同樣，海馬細胞外液中ACh含量在180～540 m in也顯著低于20 m in（P＜0．01）（圖9）。

Fig．9 Comparison of ACh efflux from m PFC and Hip of normal rats．The rats of normal control group were perfused（1．5μl·m in－1）with Ringer′s solution containing neostigmine methylsulfate 2μmol·L－1by double-probe synchronous brain microdialysis in m PFC and Hip and collected for540 m in．，n＝6．*P＜0．05，compared with Hip group at the same time；＃P＜0．05，compared with 20 m in in m PFC；△△P＜0．01，compared with 20 m in．

2．3．2 正常大鼠m PFC和海馬細胞外液中Ch含量

大鼠m PFC細胞外液中Ch含量在60，100和300～380 m in明顯高于海馬（P＜0．05），說明正常大鼠m PFC中Ch含量高于海馬區(qū)。m PFC細胞外液中Ch含量隨著采樣時間延長，在180～540 m in顯著低于20 m in（P＜0．01）。同樣，海馬細胞外液中Ch也顯著降低（P＜0．01）。這說明不同時間點m PFC和海馬細胞外液中Ch含量變化幅度很大（圖10）。

Fig．10 Level of Ch of extracellular fluid in m PFC and Hip of normal rats．See Fig．9 for the rat treatment．，n＝6．*P＜0．05，compared with Hip group at the same time；＃＃P＜0．01，com pared with 20 min in mPFC group；△△P＜0．01，compared with 20 m in in Hip group．

2．3．3 人參皂苷Rg1對m PFC和海馬細胞外液中ACh的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠m PFC細胞外液中ACh含量在140～180 m in時明顯降低（P＜0．05），而Rg1組在相應(yīng)的時間點未見明顯變化（圖11A）。

與正常對照組相比，模型組大鼠海馬細胞外液中ACh在140 m in時明顯降低（P＜0．05）。與模型組相比，Rg1組在180～260 m in ip給藥后ACh明顯升高（P＜0．05）（圖11B）。

2．3．4 人參皂苷Rg1對m PFC和海馬細胞外液中Ch含量的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠在140～260 m in時細胞外液中Ch含量明顯升高（P＜0．05，P＜0．01），在380 m in后明顯降低（P＜0．05）。Rg1組在100～260 m in也明顯高于正常對照組（P＜0．05），在180，260，460和540 m in Ch明顯高于模型組（P＜0．05）（圖12A）。

Fig．11 Effect of Rg1 on ACh efflux in m PFC（A）and Hip（B）of rats．After perfusion at baseline session，the rats in model group or Rg1 group were perfused with modified Ringer′s solution（containing NaN350μmol·L－1in N-Ringer，NaN3-N-Ringer）for120 m in in the course of modeling，and then sw itched back to N-Ringer to get perfused．Dialysate samples were taken continuously 340 m in during administration．The rats of Rg1 group were ip given Rg1 20 mg·kg－1while the perfusion with NaN3-N-Ringer ended．，n＝6．*P＜0．05，compared with normal control group；＃P＜0．05，compared with model group．

與正常對照組相比，模型組大鼠m PFC細胞外液中Ch在180～300 m in顯著升高（P＜0．01），而Rg1組在140～220 m in也顯著升高（P＜0．01）。與模型組相比，Rg1組Ch在140～260 m in明顯降低，而在340，460和540 m in明顯升高（P＜0．05）（圖12B）。

Fig．12 Effect of Rg1 on Ch efflux in m PFC（A）and Hip（B）o f rats．See Fig．11 for the rat treatment．，n＝6．*P＜0．05，**P＜0．01，com pared with normal control group；＃P＜0．05，com pared with model group．

3 討論

建立大鼠m PFC和海馬雙通道同步透析技術(shù)關(guān)鍵的兩部分是腦雙位點套管植入術(shù)和雙通道同步透析采樣。前者關(guān)鍵是明確顱骨表面2個位點之間距離要適合打孔和植入套管，便于螺釘和水泥固定。另外，鉆孔角度和植入套管的順序也很重要。根據(jù)前囟位置應(yīng)先定位海馬位點并垂直鉆孔，然后調(diào)整定位儀臂傾斜10°，確定m PFC的位點并以傾斜度打孔。植入套管按照由前向后順序，先植入m PFC位點并固定套管，然后再植入海馬位點的套管，2個套管用牙科水泥環(huán)繞固定并連接成一體，防止在插探針和透析中從顱骨上脫離。同樣，大鼠在清醒活動狀態(tài)下進行雙通道透析取樣，前提是固定好插入腦組織中2個探針，防止其在透析過程中脫落，損壞探針透析膜。而且重復(fù)插入探針對植入位點的腦組織損傷較嚴重，大鼠的應(yīng)激反應(yīng)增大，平衡時間會延長，透析液測定結(jié)果就不能客觀真實地反映藥物效用。雙位點同步透析取樣要求2個探針都能同時正常采樣，有一個探針不能順利采樣，就會影響整個透析取樣的過程。這也是雙位點BMD不容易操作和把握的技術(shù)環(huán)節(jié)。

BMD技術(shù)畢竟是一種創(chuàng)傷性取樣方法，對實驗動物的腦組織有一定損傷，應(yīng)采取一些方法盡量減少受試動物腦組織的損傷程度。植入套管操作中應(yīng)避免損傷顱骨下硬腦膜和血管，減少大量出血。出血量過多會影響動物狀態(tài)恢復(fù)，套管底部會有血凝塊存在，影響探針順利插入或是黏在透析膜外減少透析液量。另外套管植入術(shù)后給予動物抗生素，防止傷口處感染，便于受試動物恢復(fù)。也可通過延長術(shù)后動物恢復(fù)期（3～7 d）來減輕這種損傷。選取雙位點的空間距離要允許在顱骨表面操作，最好定位在2個大腦半球上。相鄰2個神經(jīng)核團由于探針的體積占位和操作不便不能采用該方法。本研究前期完成了4組雙位點套管植入術(shù)，分別為丘腦／中腦水管、前皮質(zhì)／海馬、m PFC／丘腦和m PFC／海馬。另外，雙通道同步透析時每個通道灌流速度應(yīng)控制在2．0μL·m in－1以下，流速過大對腦組織有一定損傷，也會影響透析液中神經(jīng)遞質(zhì)的含量。

雙位點BMD技術(shù)操作繁瑣，應(yīng)用上存在局限性，但只要把握上述技術(shù)關(guān)鍵，能夠準(zhǔn)確順利完成手術(shù)過程。該方法在使用較少量實驗動物的情況下獲得2個神經(jīng)核團內(nèi)多個神經(jīng)遞質(zhì)和藥物的動態(tài)變化，減少反復(fù)多次實驗造成的動物成本，降低實驗過程中存在的誤差，更能真實可靠地判斷疾病的發(fā)生發(fā)展過程和藥物干預(yù)后疾病轉(zhuǎn)歸情況，為開展在體研究中藥腦內(nèi)作用機制提供了新的技術(shù)方法和研究思路。

ACh在腦細胞外液中濃度很低（0．1～6 nm ol·L－1），Ch濃度較高（1～5μm o l·L－1）。ACh釋放后很快在突觸間隙被乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）快速分解，所以采用微透析技術(shù)采樣測定相當(dāng)困難［4－5］。局部AChE抑制劑（新斯的明或毒扁豆堿）的存在可以劑量依賴性地增加細胞外液中ACh，延長消除時間。為了便于檢測，國內(nèi)外微透析研究均在灌流液中加入AChE抑制劑。國內(nèi)同類研究中采用新斯的明濃度為10μmol·L－1［6］，國外新斯的明用量為（0．02～2）μmol·L－1［7－9］。同樣，本研究采用Ringer液中加入新斯的明2μmol·L－1同步灌流10 h，考察大鼠m PFC和海馬中ACh和Ch含量變化。結(jié)果顯示，健康大鼠m PFC細胞外液中ACh和Ch含量明顯高于海馬，這與核磁-共振波譜和微電極敏感器測定結(jié)果一致［10］。另外研究表明，NaN3能明顯降低m PFC和海馬細胞外液中ACh，但相反升高m PFC和海馬細胞外液中Ch。而人參皂苷Rg1具有逆轉(zhuǎn)NaN3導(dǎo)致的m PFC和海馬細胞外液中ACh降低和Ch升高的趨勢，能持續(xù)增加m PFC和海馬中ACh和Ch。m PFC細胞外液中ACh和Ch含量較高，受到NaN3的影響較海馬區(qū)更敏感。這說明m PFC和海馬中ACh和Ch濃度變化具有同步性和可比性。

本研究結(jié)果表明，大鼠m PFC和海馬中ACh和Ch在10 h內(nèi)波動范圍較大，m PFC和海馬細胞外液中ACh和Ch透析的前3 h均顯著高于后7 h，透析第3小時后逐漸降低，透析中后期ACh和Ch水平基本穩(wěn)定。這可能由于大鼠清醒狀態(tài)下2個探針插入并進行雙通道同步灌流，探針平衡時間較短暫（1 h），刺激尚未緩解，這使得透析前期ACh和Ch水平較高。因此，探針植入后至少要平衡2 h再開始收集透析液。另外，ACh和Ch的穩(wěn)定性不好，放置期間很容易衰減，一般取樣后即刻檢測。本研究每天進行2只大鼠的雙通道同步取樣，在透析3 h后樣品數(shù)量較多，而HPLC-IMER-ECD檢測1管樣品需要16 m in，所以透析中后期收集的樣品在檢測前放置時間會延長。這些具體情況都可能是導(dǎo)致ACh和Ch水平前后差異較大的因素。

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To establish method of determination of acetylcholine and choline in medial prefrontal cortex and hippocampus of rats by doublep robe brain synchronous micro-dialysis combined with high performance liquid chromatography with post column immobilized enzyme reactor electrochemical detection

ZHANG Mei-yu1，CAI Tie-quan2，SUN Dan-dan1，LIU Yang1，CUI Yue1，WANG Dan-qiao1
（1．Experimental Research Center，China Academy of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100700，China；2．Center for Health Food Evaluation，the State Food and Drug Administration，Beijing 100070，China）

OBJECTlVETo establish a method of synchronous dynamic monitoring of extracellular acetylcholine（ACh）and choline（Ch）in the medial prefrontal cortex（m PFC）and hippocampus of freely moving rats，which is used to analyze the changes of ACh and Ch in different brain regions through medicine intervention．METHODSThe double-probe synchronous brain microdialysis and high performance liquid chromatography with post column immobilized enzyme reactor electrochemical detection（HPLC-IMER-ECD）were established and used to monitor dynamically ACh and Ch of extracellular fluid in the m PFC and hippocampus of freely moving rats．RESULTSAfter the double-cannula implantation and dialysis sampling in the mPFC and hippocampus，the rat performance was normal．The dual-probe brain microdialysis was feasible and practical．Determination of ACh and Ch by HPLC-IMER-ECD had good linear relationship within the range of 0．02 to 2．00μmo l·L－1．The detection limit was 10 nmo l·L－1for ACh and 5 nmo l·L－1for Ch．Intra-day precision of ACh at three concntrations（0．1，0．4 and 2．0μm o l·L－1）was 0．87%－1．83%，inter-day precision of ACh was 5．38%－6．80%；Intra-day precision of Ch was 1．60%－2．91%，inter-day precision of Ch was 5．56%－7．38%．Relative recovery of ACh was 96．0%－113．0%，and that of Ch was 102．3%－110．2%．NaN3could result in the decrease of ACh（P＜0．05）and the increase of Ch（P＜0．05，P＜0．01）in both the m PFC and hippocampus．Ginsenoside Rg1 reversed the effect induced by NaN3，increased significantly ACh（P＜0．05）in the hippocampus，and decreased Ch of the mPFC and hippocampus（P＜0．05）．ACh and Ch in the m PFC were higher than in the hippocampus，and the impact of NaN3was more sensitive to changes in m PFC．CONCLUSlONDouble-probe and dual-channe l brain microdialysis technique combined with HPLCIMER-ECD can monitor synchronously the dynamic changes of ACh and Ch in the m PFC and hippocampus of conscious rats．Ginsenoside Rg1 can up-regulate the dynamic balance of ACh and Ch in the m PFC and hippocampus while enhancing central cholinergic system functions．

double-p robe brain microdialysis；high performance liquid chromatography；immobilized enzyme reactor；electrochemistry；acetylcholine；choline

WANG Dan-qiao，Tel：（010）64014411-2232，E-mail：dq＿wang96＠sohu．com；ZHANG Mei-yu，E-mail：meiyu96＠126．com，Tel：（010）64014411-2232

R965．2

A

1000-3002（2014）01-0097-10

Foundation item：The project supported by China Academy of Chinese Medicine Sciences（ZZ2010010）；China Academy of Chinese Medicine Sciences（ZZ2013007）

2013-10-10 接受日期：2013-12-26）

（本文編輯：齊春會）

中國中醫(yī)科學(xué)院自主選題研究項目（ZZ2010010）；中國中醫(yī)科學(xué)院自主選題研究項目（ZZ2013007）

張美玉（1976－），女，博士，副研究員，主要從事中藥藥理學(xué)研究；王丹巧（1959－），女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合老年醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究。

王丹巧，E-mail：dq＿wang96＠sohu．com，Tel：（010）64014411-2232；張美玉，Tel：（010）64014411-2232，E-mail：meiyu96＠126．com