表沒(méi)食子兒茶精的小鼠急性肝損傷和代謝動(dòng)力學(xué)的性別差異

葛 建，劉 洋，王夢(mèng)馨，崔 林，韓寶瑜

（中國(guó)計(jì)量學(xué)院1．生命科學(xué)學(xué)院，2．浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310018）

表沒(méi)食子兒茶精的小鼠急性肝損傷和代謝動(dòng)力學(xué)的性別差異

葛 建1，2，劉 洋1，王夢(mèng)馨1，崔 林1，韓寶瑜2

（中國(guó)計(jì)量學(xué)院1．生命科學(xué)學(xué)院，2．浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310018）

目的從對(duì)表沒(méi)食子兒茶精（EGCG）藥物代謝動(dòng)力學(xué)差異性角度，探索EGCG導(dǎo)致小鼠急性肝損傷的性別差異。方法小鼠ip給予EGCG 300 m g·kg－1后，采用試劑盒檢測(cè)小鼠血清酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、乳酸脫氫酶（LDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）和鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（OCT）的活性變化，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)肝線粒體膜電位變化，反相高效液相色譜法分析EGCG的血藥濃度，熒光免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠肝細(xì)胞中羧酸酯酶Ⅱ含量。結(jié)果小鼠ip給予EGCG后，雌雄小鼠血清中GPT和LDH均顯著升高（P＜0．05），雌性較雄性小鼠升高顯著（P＜0．01），SDH和OCT活性變化均不顯著。雌性小鼠肝細(xì)胞線粒體膜電位變化較雄性小鼠顯著（P＜0．05）。HE肝組織學(xué)觀察顯示，雌性和雄性小鼠肝組織形態(tài)變化均不明顯。但電子顯微鏡組織學(xué)觀察表明，雌性小鼠肝細(xì)胞線粒體溶脹、裂解及電子密度增加均較雄性顯著。雄性小鼠較雌性對(duì)EGCG代謝迅速，消除半衰期較短。代謝酶鑒定結(jié)果表明，羧酸酯酶Ⅱ?yàn)镋GCG發(fā)生水解反應(yīng)的主要酶類。熒光免疫組織化學(xué)法研究表明，羧酸酯酶Ⅱ在雄性小鼠體內(nèi)含量較雌性高。結(jié)論EGCG導(dǎo)致雌性小鼠急性肝損傷比雄性小鼠嚴(yán)重。

表沒(méi)食子兒茶精；急性肝毒性；毒物代謝動(dòng)力學(xué)；性別差異

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．012

茶多酚為茶葉中的主要成分，占茶葉干重的18%～36%［1］。茶多酚的主要成分是兒茶素類化合物，其中以酯型表沒(méi)食子兒茶精（epigallocatechin gallate，EGCG）含量最高，占兒茶素的50%～60%。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，EGCG具有抗癌、抗突變、預(yù)防和治療心腦血管系統(tǒng)疾病以及調(diào)理內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)和干預(yù)化學(xué)毒物引起的肝損傷和肝纖維化等生物活性［2－8］。EGCG對(duì)外源性化學(xué)毒物的解毒機(jī)制很可能通過(guò)調(diào)節(jié)核受體2介導(dǎo)的抗氧化和解毒作用［9］。體外研究表明，EGCG對(duì)細(xì)胞色素酶（CYP）類具有較強(qiáng)烈的抑制作用，從而導(dǎo)致部分藥物體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)過(guò)程的改變［10］。研究表明，EGCG能夠抑制卵巢芳香化酶活性，同時(shí)增強(qiáng)CYP3A和CYP2E1活性，但對(duì)雄性小鼠前列腺中芳香化酶未表現(xiàn)出明顯抑制作用［11］。

近年來(lái)研究表明，ip給予大劑量EGCG對(duì)肝損傷毒性較強(qiáng)，而且具有性別和種屬差異性［11］。因此，本研究在前人的基礎(chǔ)上，采用單劑量ip給予EGCG，進(jìn)一步探索EGCG肝損傷機(jī)制，同時(shí)觀察EGCG在不同性別小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)差異性，鑒定EGCG在體內(nèi)代謝酶以及酶活性的性別差異，從體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和代謝酶差異性的角度深入揭示兒茶素引起急性肝損傷性別差異性的機(jī)制，以期為兒茶素類化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域的深層次應(yīng)用和保健品研發(fā)提供理論依據(jù)和安全性參考。

1 材料與方法

1．1 試劑和儀器

EGCG標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自杭州和田生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20101012，純度＞98%；色譜甲醇和色譜乙腈，均購(gòu)自杭州米克化工儀器有限公司，其他試劑為分析純。羅丹明123，美國(guó)Sigm a公司。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、琥珀酸脫氫酶（succinic dehydrogenase，SDH）和鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（ornithine carbamyl transferase，OCT）試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。TECNAI10型透射電子顯微鏡，荷蘭FEI公司；MK-3臺(tái)式熒光檢測(cè)儀，荷蘭雷勃生物醫(yī)學(xué)有限公司；Shim adazu 20AT高效液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司；N2000色譜工作站，浙江大學(xué)智達(dá)公司。

1．2 酶活性及線粒體膜電位的測(cè)定

雌性和雄性ICR小鼠300只，體質(zhì)量23～27 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）20080033，于本實(shí)驗(yàn)室IVC獨(dú)立通氣籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將不同性別小鼠隨機(jī)分組，每組6只，分別ip給予EGCG 300 m g·kg－1，于注射前、注射后1和8 h采集血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)GPT，LDH，SDH和OCT酶活性，生理鹽水為對(duì)照組。同時(shí)按照文獻(xiàn)［12］方法制備肝細(xì)胞線粒體懸液，羅丹明染色后，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度值，根據(jù)熒光強(qiáng)度值的變化判斷EGCG對(duì)小鼠線粒體膜電位損傷。

1．3 肝組織病理學(xué)檢查

切除小鼠肝左側(cè)葉邊緣部分，于10%甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋，制備5μm厚切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。將小鼠肝組織（≤1 mm3）于2．5%戊二醛水溶液中固定2 h，PBS 0．1 m ol·L－1漂洗2次，1%鋨酸溶液染色1 h后，PBS再次漂洗，2%醋酸鈾漂洗，梯度乙醇溶液脫水，然后分別用無(wú)水乙醇和無(wú)水丙酮浸泡脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋、聚合、切片、染色后于電子顯微鏡下觀察。

1．4 EGCG高效液相色譜分析法建立

參照文獻(xiàn)［13］EGCG定量檢測(cè)方法，采用色譜柱為大連伊利特Hypersil BDS C18柱（250 mm× 4．6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈∶0．1%枸櫞酸水溶液＝10∶90；柱溫30℃，波長(zhǎng)280 nm；流速為1．0 m L·m in－1；進(jìn)樣量為20μL，外標(biāo)法定量。

精密吸取0．3 m L正常小鼠血漿，分別加入含EGCG系列工作液10μL，混勻后制成含EGCG濃度范圍0．1～200．0 m g·L－1的對(duì)照品血漿，分別向其中加入20%維生素C水溶液30μL，混勻后加入乙酸乙酯3 m L，渦漩1 m in，低溫離心5 m in后取出有機(jī)相于尖底玻璃離心管中，按上述方法重復(fù)萃取1次，合并有機(jī)相于氮?dú)饬飨?0℃水浴揮干，向殘?jiān)屑尤?．1 m L 20%乙腈水溶液，3 181×g高速離心后取20μL行HPLC分析。按上述方法制備分別含EGCG 0．2，10．0和50．0 m g·L－1質(zhì)控樣品，按照上述方法處理后進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度重復(fù)5次，以樣品中藥物與直接溶于流動(dòng)相下峰面積比值，計(jì)算EGCG 0．2，10．0和50 m g·L－1濃度下提取回收率。比較以上樣品于日內(nèi)5次和日間5次測(cè)定的峰面積變化，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。同時(shí)將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算EGCG濃度，與加入濃度比較，求得方法回收率，用以表示分析方法準(zhǔn)確度。

制備含EGCG 10．0和50．0 m g·L－1的血漿樣品，室溫保存，按照上述處理方法分別于0，1，3和7 h各一式3份進(jìn)行測(cè)定；同時(shí)按照上述相同方法配制含EGCG 10．0和50．0 m g·L－1的血漿樣品于－20℃保存，分別于0，5，10和30 d各一式3份進(jìn)行處理測(cè)定，計(jì)算不同保存條件和放置時(shí)間下EGCG濃度變化來(lái)反映樣品穩(wěn)定性。

1．5 計(jì)算EGCG血藥濃度和藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

雌性和雄性ICR小鼠隨機(jī)分組，每組5只，單次ip給予EGCG 150 m g·kg－1，分別于注射后2，15，30 m in，1，2，4，8，12和18 h眼球取血，分離血漿，根據(jù)文獻(xiàn)［14］方法處理血漿樣品，按照1．4方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血漿中EGCG含量，繪制血藥濃度時(shí)間曲線，利用藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算公式，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1．6 EGCG代謝酶的鑒定

制備正常小鼠血漿，設(shè)生理鹽水組、毒扁豆堿組、普魯卡因胺組、辛硫磷組和洛哌丁胺組，分別向血漿中加入上述不同水解酶特異性抑制劑，終濃度為30 m g·L－1，混勻后向每組血漿中加入EGCG標(biāo)準(zhǔn)液，使得終濃度為50 m g·L－1，放入37℃水浴中反應(yīng)0，5，10和30 m in，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)其中EGCG含量，根據(jù)EGCG濃度變化速率鑒定EGCG體內(nèi)的主要代謝酶。

1．7 不同性別小鼠EGCG代謝酶活性的測(cè)定

向雌性和雄性小鼠血漿中加入一定濃度的EGCG，分別于37℃水浴中反應(yīng)0，5，10和30 m in，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)其中EGCG含量，根據(jù)EGCG濃度變化速率來(lái)判斷不同性別小鼠血漿中代謝酶活性差異。

1．8 熒光免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)CES-Ⅱ蛋白表達(dá)

雌性和雄性小鼠的肝組織經(jīng)約5%甲醛，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為6μm。切片脫蠟水化，枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，加入一抗（CES-Ⅱ抗體），4℃冷藏2 h，室溫放置30 m in，PBS緩沖液沖洗后加入FITC標(biāo)記的二抗，室溫孵育15 m in，PBS緩沖液洗片，封片，熒光顯微鏡觀察，出現(xiàn)綠色熒光者記為陽(yáng)性細(xì)胞。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1EGCG對(duì)不同性別小鼠的急性肝損傷作用

小鼠大劑量單次ip給予EGCG后1和8 h，雌性和雄性小鼠血清中GPT，LDH，SDH和OCT活性與對(duì)照組相比均有所改變，其中雌性和雄性小鼠血清中GPT含量變化具有顯著性差異（P＜0．05），與文獻(xiàn)［11］報(bào)道結(jié)果相一致（表1）。同時(shí)肝細(xì)胞線粒體膜電位損傷研究結(jié)果顯示，ip給予EGCG后雌雄小鼠線粒體均受到顯著破壞，其中雌性小鼠損傷較雄性嚴(yán)重（圖1）。

Tab．1 Effect of epigallocatechin gallate（EGCG）on GPT，LDH，SDH and OCT activity in male and female lCR mice

Fig．1 Effect of EGCG on mitochondrial membrane potential in livers of male and female mice．See Tab．1 for mouse treatment．，n＝6．*P＜0．05，**P＜0．01，compared with female mice at the same time．

組織學(xué)檢查結(jié)果表明，EGCG所致急性毒性肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯的肝壞死，肝索和肝血竇清晰可見(jiàn)（圖2）。電子顯微鏡觀察顯示，雌性小鼠肝細(xì)胞中線粒體明顯溶脹和溶解（圖3B），雄性小鼠線粒體損傷較雌性輕（圖3C）。

Fig．2 Effect of EGCG on liver morphological changes of male and female mice（HE×200）．See Tab．1 for the mouse treatment．A：normal control；B：male mice，8 h after administration of EGCG；C：female mice，8 h after administration of EGCG．

Fig．3 Effect of EGCG on subcellular structure of livers of male and female mice（×15 000）．See Tab．1 for the treatment．A：normal control；B：male mice，8 h after administration of EGCG；C：female m ice，8 h after administration of EGCG．Arrows show mitochondria in hepatocytes．

2．2 血漿中EGCG檢測(cè)方法

在本研究樣品的處理方法和色譜條件下，血漿在EGCG 0．1～200．0 m g·L－1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，在EGCG保留時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn)（圖4）。利用線性回歸方程計(jì)算出斜率、截距以及相關(guān)系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝12037x＋560．33（r＝0．9999）。EGCG在血漿中的回收率＞85．0%，日內(nèi)和日間變異系數(shù)均＜10%，準(zhǔn)確度＞95%，說(shuō)明EGCG在小鼠血漿中回收率較好，精密度和準(zhǔn)確度符合檢測(cè)要求（表2）。同時(shí)穩(wěn)定性檢測(cè)顯示EGCG 10．0和50．0 m g·L－1室溫保存的相對(duì)濃度分別為100．0%，98．5%，97．6%和96．9%以及100．0%，98．0%，96．6%和95．6%。－20℃保存的相對(duì)濃度分別為100．0%，100．2%，100．5%，99．5%和100．0%，99．8%，98．7%和97．0%。結(jié)果表明，室溫下樣品至少可以穩(wěn)定7 h，－20℃樣品至少可以穩(wěn)定30 d。

Fig．4 Chromatographs of EGCG in serum．A：EGCG standard；B：blank plasma；C：blank plasma spiked with EGCG；D：plasma chromatogram after administration；Peak 1：EGCG．

Tab．2 Plasm a recovery，accuracy and precision of EGCG in serum of mice

2．3 EGCG在雄性和雌性小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)的比較

圖5為血藥濃度和時(shí)間曲線圖。根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算公式得出EGCG藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示，EGCG在雄性小鼠體內(nèi)半衰期較雌性短，清除率較雌性大，說(shuō)明其在雄性小鼠體內(nèi)代謝清除較雌性快。

Fig．5 Concentration-time curve of plasma EGCG in male and female mice．Mice were ip given EGCG 150 mg·kg－1，plasma was collected at0，2，15，30 min and 1，2，4，8，12，18 h，and plasma concentrations were determined by high performance liquid chromatography．，n＝5．

2．4 EGCG血清中的代謝酶

圖6結(jié)果表明，生理鹽水對(duì)照組代謝較迅速，毒扁豆堿組代謝與對(duì)照組相似，普魯卡因胺和洛哌丁胺組EGCG代謝曲線變化較平緩，說(shuō)明可不同程度地抑制EGCG的代謝，辛硫磷組抑制最強(qiáng)烈，由于辛硫磷為酯酶類非特異性強(qiáng)烈抑制劑，普魯卡因胺和洛哌丁胺分別為羧酸酯酶Ⅰ和Ⅱ的特異性抑制劑。因此提示，EGCG在血漿中主要為羧酸酯酶Ⅰ和Ⅱ所代謝。

Tab．3 Pharmacokinetic parameters of EGCG 300 m g·kg－1in m ale and fem ale m ice

Fig．6 Metabolic inhibition of EGCG by different inhibitors．，n＝5．

2．5 不同性別小鼠EGCG代謝酶活性差異

圖7結(jié)果表明，EGCG在雄性小鼠血漿中代謝較雌性小鼠迅速。

Fig．7 In vitro metabolism of EGCG in plasma of male and female mice，n＝5．

2．6 不同性別小鼠肝細(xì)胞CES-Ⅱ蛋白表達(dá)差異

熒光免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，雌雄小鼠肝細(xì)胞中CES-Ⅱ表達(dá)量均較高（圖8），尤以肝小葉中央靜脈處含量最高。雌雄肝組織表達(dá)量比較表明，雄鼠肝組織中CES-Ⅱ的表達(dá)量明顯高于雌鼠肝組織，并與代謝酶活性檢測(cè)結(jié)果相一致。

Fig．8 Effect of EGCG on CES-Ⅱexpression in livers of male（A）and female（B）mice（×400）．

3 討論

本研究結(jié)果顯示，單劑量ip給予EGCG表現(xiàn)出明顯急性肝損傷，同時(shí)也具有明顯的性別差異性，與文獻(xiàn)研究結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG引起肝損傷的主要部位為線粒體損傷，可能是EGCG作用于線粒體膜轉(zhuǎn)換蛋白，從而引起線粒體膜電位的顯著改變，進(jìn)而表現(xiàn)出肝細(xì)胞損傷。至于EGCG導(dǎo)致線粒體膜轉(zhuǎn)換蛋白發(fā)生改變的機(jī)制有待進(jìn)一步研究，根據(jù)文獻(xiàn)推斷有可能為EGCG干擾了肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子流的變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子泵的開(kāi)放紊亂，引起肝細(xì)胞損傷［4］。

兒茶素類化合物藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果也顯示，此類物質(zhì)在體內(nèi)生物利用度較低，主要表現(xiàn)在EGCG難以通過(guò)小腸上皮細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)［15］，而且進(jìn)入血液中的EGCG又較易被水解代謝，從而使得經(jīng)口服未見(jiàn)明顯毒性。然而，腹腔注射EGCG，其生物利用度較高，與靜脈注射相當(dāng)，因此大劑量、長(zhǎng)期腹腔或靜脈注射EGCG均能表現(xiàn)出明顯的毒性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG在小鼠體內(nèi)的主要代謝部位為血液，代謝反應(yīng)主要為水解反應(yīng)，由于EGCG為內(nèi)酯型兒茶素，因此推斷血漿中酯酶可能為EGCG代謝的主要酶類，它們包括膽堿酯酶和羧酸酯酶兩大類。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肟硫磷為酯酶的非特異性抑制劑，毒扁豆堿為膽堿酯酶的特異性抑制劑，而普魯卡因胺和洛哌丁胺分別為羧酸酯酶Ⅰ和Ⅱ的特異性抑制劑［16－17］，本研究發(fā)現(xiàn)EGCG主要被羧酸酯酶所代謝，羧酸酯酶Ⅱ較酯酶Ⅰ對(duì)EGCG代謝強(qiáng)。根據(jù)EGCG結(jié)構(gòu)可知，EGCG屬于“小酰基大羥基”酯型化合物，此類化合物在體內(nèi)主要為CES-Ⅱ水解，與抗癌藥伊立替康體內(nèi)代謝結(jié)果相一致［18］。將此類抑制劑與兒茶素聯(lián)用，可降低EGCG在體內(nèi)的水解代謝速率，從而延長(zhǎng)其在體內(nèi)的駐留時(shí)間，增加其藥理活性。

雌雄動(dòng)物由于生理生化機(jī)制不同，往往表現(xiàn)在對(duì)外源性化合物的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程也明顯不同。有文獻(xiàn)報(bào)道，雷公藤甲素在雌雄大鼠體內(nèi)表現(xiàn)出明顯的毒性差異，原因主要是它們對(duì)雷公藤甲素的代謝過(guò)程有差異［19］。研究EGCG體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的文獻(xiàn)大多限于體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程，對(duì)不同性別代謝差異性研究未見(jiàn)報(bào)道，其差異性機(jī)制的研究更少。本研究在雌雄小鼠發(fā)現(xiàn)EGCG藥代動(dòng)力學(xué)差異性可以解釋EGCG對(duì)雌雄小鼠肝損傷差異性機(jī)制。

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［16］ Takahashi S，Katoh M，Saitoh T，Nakajima M，Yokoi T．Different inhibitory effects in rat and human carboxylesterases［J］．Drug Metab Dispos，2009，37（5）：956-961．

［17］ Kobayashi Y，F(xiàn)ukami T，Shimizu M，Nakajima M，Yokoi T．Contributions of arylacetamide deacetylase and carboxylesterase 2 to flutamide hydrolysis in human liver［J］．Drug Metab Dispos，2012，40（6）：1080-1084．

［18］ Hosokawa M．Structure and catalytic properties of carboxylesterase isozymes involved in metabolic activation of prodrugs［J］．Molecules，2008，13（2）：412-431．

［19］ Liu L，Jiang Z，Liu J，Huang X，W ang T，Liu J，et al．Sex differences in subacute toxicity and hepatic microsomal metabolism of triptolide in rats［J］．Toxicology，2010，271（1-2）：57-63．

（本文編輯：付良青）

文獻(xiàn)類型標(biāo)志符號(hào)含義及統(tǒng)計(jì)表的書(shū)寫(xiě)原則

1．文獻(xiàn)類型標(biāo)志如下：普通圖書(shū)M，會(huì)議錄C，匯編G，報(bào)紙N，期刊J，學(xué)位論文D，報(bào)告R，標(biāo)準(zhǔn)S，專利P，數(shù)據(jù)庫(kù)DB，計(jì)算機(jī)程序CP，電子公告EB。會(huì)議錄包括座談會(huì)、研討會(huì)、學(xué)術(shù)年會(huì)等會(huì)議的文集；匯編包括多著者或個(gè)人著者的論文集，也可標(biāo)注為M。

電子文獻(xiàn)載體類型標(biāo)志如下：磁帶MT，磁盤DK，光盤CD，聯(lián)機(jī)網(wǎng)絡(luò)OL。

2．統(tǒng)計(jì)表內(nèi)不應(yīng)空格，若使用符號(hào)表示“未測(cè)”或“未做”，可用“…”或“ND”表示；如果表示“未測(cè)到”或數(shù)值小于有效數(shù)字，可用“－”或“0．0”“0．00”（據(jù)有效數(shù)字位數(shù)而定）。

Gender role in acute hepatotoxicity and pharmacokinetics of epigallocatechin gallate in mice

GE Jian1，2，LIU Yang1，WANG Meng-xin1，CUILin1，HAN Bao-yu2
（1．College of Life Sciences，2．Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection＆Quarantine，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China）

OBJECTlVETo investigate the possible mechanism and sex-dependence of hepatotoxicity induced by epigallocatechin gallate（EGCG）after administration by intraperitoneal injection．METHODSICR mice were ip given EGCG 300 m g·kg－1．Their plasma enzyme activity and mitochondrial membrane potential（MMP）were detected and used as indicators of hepatic dam age．Liver histology was examined by light and electron microscopy．Then，the sex-dependent toxicokinetics and expression of carboxylesteraseⅡwere both determined．RESULTSGlutamic-pyruvic transaminase（GPT）and lactate dehydrogenase（LDH）values significantly increased in serum of mice．GPT increased more significantly in female mice than in male mice．However，the succinic dehydrogenase（SDH）and ornithine carbamyl transferase（OCT）values in serum did not increase significantly between female and male mice．EGCG also contributed to the changes in MMP in the livers of female and male mice after intraperitoneal injection．MMP increased m ore in female mice than in male mice．Although liver slices stained with hematoxylin and eosin revealed few necrotic cells in male and female mice，liver his to logy examined by an electron microscope demonstrated that EGCG produced severe hepatic damage at the subcellular level．Sex-different toxicokinetics showed faster elimination of EGCG in male m ice than in female ones．EGCG was mainly metabolized by hydrolysis and carboxylesteraseⅡwas determined to be the main metabolic enzyme in m ice．Immunohistochemistry detection showed that the protein expression of carboxylesteraseⅡwas very lower in female mice than in male ones．CONCLUSlONEGCG produces more severe hepatotoxicity in female mice than in male ones．

epigallocatechin gallate；acute hepatotoxicity；toxicokinetics；sex difference

HAN Bao-yu，E-mail：hanbaoyu＠cjlu．edu．cn，Tel：（0571）86835706

R969．1

A

1000-3002（2014）01-0074-07

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（31100499）；National Natural Science Foundation of China（31071744）；and Zhejiang Provincial Innovative Research Team Project of Undergraduate in 2012

2013-03-18 接受日期：2013-08-21）

國(guó)家自然科學(xué)基金（31100499）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31071744）；2012年浙江省大學(xué)生科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助（新苗人才項(xiàng)目）

葛 建（1979－），男，博士，副教授，從事天然產(chǎn)物毒理學(xué)及代謝動(dòng)力學(xué)研究，E-mail：gejian16888＠163．com。

韓寶瑜，E-mail：hanbaoyu＠cjlu．edu．cn，Tel：（0571）86835706