急性淋巴細胞白血病病人Ikaros6基因表達及意義

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(青島大學醫(yī)學院，山東 青島 266021 1 血液學教研室； 2 附屬醫(yī)院血液病研究室)

Ikaros是Kruppel家族中鋅指轉(zhuǎn)錄因子之一，其對淋巴細胞分化、增殖和功能維持具有重要的調(diào)控作用[1-4]。編碼Ikaros蛋白的基因(IKZF1)由N端4個結(jié)合DNA的鋅指域和C端有2個蛋白相互作用的鋅指域構(gòu)成，其基因外顯子的不同剪接轉(zhuǎn)錄可以編碼至少12種不同的鋅指蛋白(Ikaros1～Ikaros12)，均具有不同的DNA結(jié)合能力及特異性[3]。Ikaros要發(fā)揮結(jié)合DNA作用至少需要3個N端的鋅指結(jié)構(gòu)，而一旦缺失兩個或以上的鋅指結(jié)構(gòu)，其蛋白與DNA結(jié)合能力就會下降，也不具備轉(zhuǎn)錄活性，同時也會抑制其他異構(gòu)體對DNA的結(jié)合能力，表現(xiàn)為顯性負效應(DN)[5]。有研究表明，Ph染色體陽性的急性淋巴細胞白血病(Ph+-ALL)病人中Ikaros6 基因的突變率較高、治療效果差[6-9]。但絡氨酸酶抑制劑(TKIs)和VDCP這兩種治療方案對Ph+-ALL病人的治療效果尚未見詳細報道。本研究旨在進一步明確Ikaros6基因異常表達與Ph+-ALL治療效果的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 研究對象

2011年7月—2013年7月，在青島大學醫(yī)學院各附屬醫(yī)院就診的ALL病人95例，男46例，女49例；年齡16～82歲，中位年齡49歲。Ph+-ALL病人分別接受TKIs聯(lián)合化療治療和僅VDCP(長春新堿(VCR)、柔紅霉素(DNR)、環(huán)磷酰胺(CTX)、強的松(Prec))治療。因Ph染色體陰性的ALL(Ph--ALL)病人Ikaros6基因表達低，故不再進行跟蹤隨訪。以上病人的診斷、治療及療效判定標準均參照文獻[10]。選擇10例健康體檢者為健康對照組，男5例，女5例；年齡18～58歲，中位年齡38歲。

1.2 染色體核型分析

將ALL病人骨髓細胞按(1～2)×109/L的密度接種于RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，于收獲前1 h，加入0.05 mg/L秋水酰胺終止反應[11]。采用氣干法制片進行染色體R顯帶；每例病人于油鏡下分析10～20個分裂中期細胞，依據(jù)《人類細胞遺傳學國際命名體制(1995)》觀察有無染色體異常。

1.3 RT-PCR檢測Ikaros6基因表達

1.3.1總RNA提取 取肝素抗凝的骨髓液2 mL，加等量的人淋巴細胞分離液，以2 000 r/min 離心15 min，分離單個核細胞，加Trizol試劑(美國Invitrogen公司)1 mL，按照試劑說明書進行細胞總RNA提取并檢測RNA純度(A260/A280>1.60)及完整性(28S、18S、5S等3條清晰亮帶)。

1.3.2cDNA合成 應用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)合成cDNA。反應體系20 μL，含總RNA 1 μg、0.5 g/L的OLigo(dT)18引物1 μL，使用DEPC水補充至12 μL；快速輕微離心后，置65 ℃孵育5 min，立即置于冰上；然后依次加入5×緩沖液4 μL、RNase抑制劑1 μL、10 mmoL/L dNTP Mix 2 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV) 1 μL混勻，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3PCR反應 PCR反應體系10 μL，含逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，20 μmol/L的Ikaros6正、反義鏈引物各0.5 μL，5×PCR Mix 5 μL，用DEPC水補至10 μL。PCR條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。所用引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，Ikaros6 正義鏈為5′-CGACGCACAA-ATCCACATAA-3′，反義鏈為5′-GCAGCAGCAGGTTCTCCAC-3′。

1.4 基因測序

將標本外送到金斯瑞生物科技公司進行純化并測序。運用BLAST對測序結(jié)果和正常序列(基因庫ID:NM006060)進行比對，確定相對應的突變位置和類型[12]。

1.5 熒光定量PCR檢測Ikaros6基因的表達

1.5.1熒光定量PCR反應 PCR擴增反應體系為50 μL，含10 mg/L 模板DNA 5 μL，20 μmol/L的Ikaros6正、反義鏈引物各0.5 μL，F(xiàn)ast Start Universal SYBR Green Master 25 μL和DEPC水19 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，62 ℃退火、延伸60 s，40個循環(huán)。然后進行熔解曲線分析，由62 ℃始以0.1 ℃/s上升至96 ℃，最后冷卻至40 ℃。Ikaros6引物和1.3.3中所用引物相同，設內(nèi)參照GAPDH，引物序列為：正義鏈5′-C-AAGGTCATGACAACTTTG-3′，反義鏈5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.5.2熒光定量PCR結(jié)果計算 Ikaros6 mRNA相對表達量以2-△△CT表示，△△CT=(△CTIkaros6初診-△CT內(nèi)參照)-(△CTIkaros6緩解-△CT內(nèi)參照)[12]。其中CT值表示每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。兩組間計量資料的比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗，以P<0.05表示差異有顯著意義。

2 結(jié) 果

2.1 ALL病人染色體核型分析

本文95例ALL病人中，45例檢測到Ph染色體，其中38例為典型易位即t(9;22)(q34;q11)，7例為變異易位；50例未檢測到Ph染色體。

2.2 Ikaros6基因的表達

本文45例Ph+-ALL病人中有13例(28.9%)表達Ikaros6基因，50例Ph--ALL病人中僅有2例(4.0%)表達該基因，Ph+-ALL病人Ikaros6基因表達率明顯高于Ph--ALL病人(χ2=11.03，P<0.05)。健康對照組中均未檢測到Ikaros6基因的表達。見圖1。

2.3 Ikaros6基因測序

對克隆篩選出來的表達Ikaros6基因的標本進行測序，證實Ikaros6基因突變是由于IKZF1中外顯子4～7的缺失所致。見圖2。

M：Marker 2000；①、②表達Ikaros6基因；③、④分別表達Ikaros1和Ikaros2基因。

圖2 Ikaros6基因測序圖

2.4 Ikaros6基因與臨床療效

2.4.1Ph+-ALL病人初診時和緩解后Ikaros6基因表達的比較 12例初診病人Ikaros6 mRNA平均表達量(△△CT=3.4)明顯高于緩解后(△△CT=5.0，11例，1例病人始終未達到血液學上的緩解)，差異有顯著性(t=4.054，P<0.05)。

2.4.2Ikaros6基因表達與初診病人短期緩解率表達Ikaros6基因的病人中，6例接受TIKs治療僅1例(16.67%)獲得緩解，7例接受VDCP治療有2例(28.57%)獲得緩解，兩組比較差異無顯著意義(P>0.05)。未表達Ikaros6基因的病人中，7例接受TIKs治療6例(85.71%)獲得緩解，25例接受VDCP治療僅9例(36.00%)獲得緩解，兩組比較差異有顯著性(χ2=5.43,P<0.05)。接受TIKs治療的病人中，表達Ikaros6組的緩解率明顯低于未表達Ikaros6組(16.67% vs 85.71%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.20,P<0.05)。接受VDCP治療的病人中，表達Ikaros6組和未表達Ikaros6組的緩解率(28.57% vs 36.00%)比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.4.3Ikaros6基因表達與累積復發(fā)時間 經(jīng)隨訪，Ph+-ALL病人中表達Ikaros6基因者20個月平均累積復發(fā)時間明顯短于未表達Ikaros6基因者(4.6月vs 12.2月；Waldχ2=13.72,P<0.05)。

3 討 論

Ph染色體是成人ALL最常見的重現(xiàn)性細胞遺傳學異常，約占20%～30%，它也是影響ALL預后的重要因素之一。如何對ALL進行快速診斷、分類并作出相應的合理治療，已引起國內(nèi)外學者的普遍關(guān)注。Ikaros在造血細胞，特別是B細胞的發(fā)育和分化中具有重要的作用，Ikaros基因一旦發(fā)生突變，轉(zhuǎn)錄水平的表達將會進一步減少或抑制正常功能基因亞型與DNA的結(jié)合，最終引發(fā)相應白血病。然而，在ALL病人中，異常的Ikaros6 基因表達與急性白血病的發(fā)生、發(fā)展及預后等方面是否有關(guān)聯(lián)，至今尚無明確的結(jié)論。

本研究結(jié)果顯示，IKZF1中外顯子4～7的缺失是導致Ikaros6基因表達的主要原因，該基因在Ph+-ALL病人中高表達，與IACOBUCCI等[7]和MARTINELLI等[9]的研究結(jié)論基本一致。說明Ikaros6基因突變能抑制或減少正?；蚧钚裕荘h+-ALL發(fā)病機制的重要因素。然而，Ikaros6基因陽性的Ph+-ALL具體發(fā)病機制尚不清楚，目前認為可能與以下因素有關(guān)：Ikaros基因與前B細胞中c-myc的啟動子結(jié)合，抑制前B細胞中c-myc的表達，Ikaros6 基因抑制或減少其他Ikaros基因與DNA的結(jié)合，從而引起c-myc基因高表達，導致前B細胞的過度增生[13]；Ikaros基因可以調(diào)節(jié)B細胞中JAK-STAT信號通路[14]，突變的Ikaros6基因可不斷激活該信號通路，從而導致B細胞過度增生。

熒光定量PCR是一種核酸定量技術(shù)，其具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確等優(yōu)點，故本研究采用該方法檢測Ikaros6陽性病人mRNA表達量。結(jié)果顯示，初診時Ikaros6 mRNA具有較高的表達量，這可能與Ikaros6 mRNA轉(zhuǎn)錄的動態(tài)表達量和臨床分期相關(guān)，在疾病的初發(fā)期，其轉(zhuǎn)錄水平明顯增高，治療達到緩解后，其表達量明顯下降。

通過隨訪顯示，未表達Ikaros6 基因的病人，采用TKIs治療可獲得較高的緩解率，目前仍然是最佳的治療方案，而Ikaros6基因陽性表達的病人，兩種治療方案的緩解率均較低，這說明在Ph+-ALL病人中，Ikaros6基因表達對TKIs具有明顯的抵抗性。MARTINELLI等[9]的研究結(jié)果顯示，在Ph+-ALL病人中，異常的Ikaros6基因表達與抵抗TKIs的治療之間存在一定的相關(guān)性。本文的研究結(jié)果與其一致。CHARLES等[15]的研究結(jié)果也表明，Ikaros6 基因表達與B-ALL病人的預后不良存在聯(lián)系。目前TKIs治療Ph+-ALL病人的療效尚存在不同意見，VIGNETTI等[16]認為，Ph+-ALL病人接受TKIs治療有較高的完全緩解率，接近98%～100%，這可能與不同種族及樣本量的多少有關(guān)。

Ph+-ALL病人中表達Ikaros6基因者20個月平均累積復發(fā)時間明顯短于未表達Ikaros6基因者，陽性表達病人均在1年內(nèi)復發(fā)。說明Ikaros6基因在Ph+-ALL的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，并與病人的療效和預后有著密切的聯(lián)系。同時，表達Ikaros6基因的Ph+-ALL病人對TKIs的治療具有抵抗性，且治療后易復發(fā)。

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