減數(shù)分裂實(shí)驗(yàn)材料的優(yōu)化與染色體制備技術(shù)改進(jìn)

徐根娣, 陳析豐, 柯卡茹

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 金華 321004)

減數(shù)分裂和染色體行為觀察是遺傳學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，有利于學(xué)生深刻認(rèn)識(shí)遺傳學(xué)規(guī)律和提高教學(xué)質(zhì)量。恰當(dāng)?shù)倪x擇實(shí)驗(yàn)材料，高質(zhì)量的制片技術(shù)，對(duì)幫助學(xué)生理解減數(shù)分裂過程中同源染色體發(fā)生配對(duì)和分離，非同源染色體重新組合或部分同源染色體間的交換，具有非常重要的意義[1]。減數(shù)分裂的動(dòng)物取材主要是蝗蟲。因蝗蟲染色體數(shù)目較少，染色體較大，并且雄性蝗蟲在繁殖季節(jié)中處于減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞多，在實(shí)驗(yàn)中容易觀察到，因而入選實(shí)驗(yàn)教材[2]。但是在實(shí)際教學(xué)過程中，學(xué)生在有限時(shí)間內(nèi)不易找出減數(shù)分裂各時(shí)期及其對(duì)應(yīng)特征，且制片速度慢，制出的片子效果不好，如有的染色不深或未染上色，甚至觀察不到分裂相。因此，根據(jù)筆者多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，從蝗蟲品種、捕捉時(shí)間和精細(xì)管取材部位來獲取分裂相較多的細(xì)胞，并結(jié)合醋酸洋紅染液分步轉(zhuǎn)移染色，提高染色效果，從而提高實(shí)驗(yàn)效率和獲得較好教學(xué)效果。

1 蝗蟲精巢材料的篩選

1.1 蝗蟲品種和捕捉時(shí)間選擇

浙江金華的10月—11月份是蝗蟲繁殖高峰期，本試驗(yàn)在10月20日到10月30日之間用捕蟲網(wǎng)捕捉。為了解一天中是否存在分裂相最旺盛的時(shí)段，按早、中、晚3個(gè)時(shí)間段進(jìn)行捕捉。早、中、晚時(shí)間安排分為早9:30—10:30，中12:30—13:30，晚16:30—17:30。在校園附近操場(chǎng)分別捕捉青脊竹蝗、疣蝗、稻蝗和笨蝗的雄性成體，每個(gè)品種8～10只，將蟲體的翅膀和后肢剪去，以免飛走，按品種分別放入200 mL燒杯中，扣上蓋子備用。

1.2 精巢取材部位的選擇

分別選取蝗蟲精細(xì)管的不同部位進(jìn)行制片觀察，從中篩選出分裂相較多的部位。第1種方法為三段取材法，即蝗蟲精細(xì)管分為前、中、后3個(gè)部分，前段為靠近精細(xì)管圓端處，中部為精細(xì)管中部，后端為精細(xì)管細(xì)端處(圖1)。第2種方法為二段取材法，即把蝗蟲精細(xì)管從中部均勻分為2段。

2 材料與方法[3-6]

2.1 解剖材料

對(duì)采集來的不同蝗蟲品種的雄性個(gè)體進(jìn)行活體解剖。分別將已剪去翅膀和后肢的雄性蝗蟲取出，用手術(shù)剪去頭部，沿蟲體胸腹部中間從頭部端向尾部端剪開，并撐開已解剖的腹部體壁，用小鑷子先將胃腸等器官夾出棄去后，在體壁處可見深黃色的精巢，夾出精巢，放入PBS緩沖液中去除其表面的結(jié)締組織等附著物。然后，換入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%KCl低滲30 min，使細(xì)胞膨脹，利于染色體鋪展開來。再轉(zhuǎn)入卡諾固定液(無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中固定10～24 h，期間換1～2次固定液，充分脫脂。固定結(jié)束后，深黃色精巢變成肉眼能見由細(xì)管組成的白色精巢，直接放入75%乙醇，并置4℃的冰箱保存。

2.2 制片操作

以往的實(shí)驗(yàn)大多采用一次染色法[7]。在本實(shí)驗(yàn)中采用不同濃度的醋酸洋紅染液分步轉(zhuǎn)移染色。主要步驟：隨機(jī)選取已固定并保存的蝗蟲精巢，按每個(gè)品種每個(gè)捕捉時(shí)間段2只蝗蟲精巢的全部精細(xì)管制片。取整個(gè)精巢于加有0.5%醋酸洋紅染液的染色盤中，小心將精細(xì)管全部分開，染色10～15 min，然后分別取精細(xì)管放于加有1～2滴1%醋酸洋紅染液的載玻片中央，用鋒利的刀片將細(xì)管分成3段或2段，彼此分開，再染色3～5 min，蓋上蓋玻片，同時(shí)覆上吸水紙，壓片。壓片時(shí)左手拇指或食指壓住左側(cè)蓋玻片以幫助固定，防止蓋玻片的滑動(dòng)，用拇指指腹垂直地用力加壓，為使細(xì)胞分散，也可用帶橡皮頭的鉛筆，用橡皮頭對(duì)準(zhǔn)材料處輕敲，后拿載玻片對(duì)光觀察，見標(biāo)本呈薄霧狀即可觀察。

2.3 制片觀察

將制備好的制片放在顯微鏡的載物臺(tái)上，先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡，調(diào)節(jié)顯微視野的明暗度進(jìn)行觀察。觀察細(xì)胞分裂相中不同形態(tài)的染色體，根據(jù)所學(xué)的理論指導(dǎo)，判斷出細(xì)胞的分裂時(shí)期。

3 結(jié)果與分析

3.1 蝗蟲品種

分別對(duì)青脊竹蝗、疣蝗、稻蝗和笨蝗的減數(shù)分裂制片進(jìn)行觀察(表1)。結(jié)果表明，稻蝗具有分裂相的制片數(shù)、2～3個(gè)減數(shù)分裂時(shí)期的制片數(shù)、4個(gè)以上減數(shù)分裂時(shí)期的制片數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它3個(gè)蝗蟲品種，其次是笨蝗，青脊竹蝗和疣蝗的具有分裂相、2～3個(gè)減數(shù)分裂時(shí)期的制片數(shù)和4個(gè)以上減數(shù)分裂時(shí)期的制片數(shù)均較少?？梢姕p數(shù)分裂實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞與蝗蟲的品種有關(guān)，稻蝗是較好的蝗蟲材料。

3.2 蝗蟲捕捉時(shí)間

為了明確蝗蟲的減數(shù)分裂是否與蝗蟲的時(shí)間活動(dòng)節(jié)律有關(guān)，選取早(9:30—10:30)、中(12:30—13:30)和晚(16:30—17:30)3個(gè)時(shí)間段捕獲蝗蟲。早、中和晚具有分裂相的制片百分?jǐn)?shù)分別為43.2%、43.2%和44.7%，2～3個(gè)分裂時(shí)期的制片百分?jǐn)?shù)在早、中和晚分別是29.1%、28.9%和30.1%，4個(gè)以上分裂在早、中和晚時(shí)期的制片百分?jǐn)?shù)為10.2%、10.2%和11.2%。4個(gè)品種的蝗蟲具有分裂相與減數(shù)分裂制片數(shù)在3個(gè)時(shí)間段內(nèi)接近，可見時(shí)間節(jié)律并不是影響精母細(xì)胞分裂的主要因素。

表1蝗蟲減數(shù)分裂情況

3.3 取材部位

稻蝗的精細(xì)小管后端膨大非常明顯(圖1A)，而疣蝗的精細(xì)小管呈細(xì)長(zhǎng)狀，后端無(wú)明顯膨大(圖1B)。取材時(shí)在體視鏡下將櫛比排列的精細(xì)管撥開，三段取材法中選取精細(xì)管圓端處和精細(xì)管中部膨大明顯的精細(xì)小管(圖1A)，或是二段取材法中選取精細(xì)管靠近圓端處，可以觀察到有較多的減數(shù)分裂相(表2, 圖2 A和B)。而后端無(wú)明顯膨大的精細(xì)小管，沒壓出內(nèi)容物，處于其分裂相較少或沒有(圖1B)。因此，選材時(shí)應(yīng)有針對(duì)性地挑選后端膨大明顯的精細(xì)小管(圖1A)，使處于分裂相的細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定。

圖1 稻蝗(A)和疣蝗(B)的精細(xì)小管

++++++++-+++++++++++-++++++++++++++++++++++++++++-++++

圖2稻蝗細(xì)胞的減數(shù)分裂觀察(A, B)

Fig 2 The meiosis observation inOxyachinensisThunb (A, B)

4 體會(huì)

“減數(shù)分裂”既是生物有性生殖過程中的一個(gè)重要階段，也是遺傳學(xué)三大規(guī)律的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[8]。針對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問題，筆者進(jìn)行了一系列探究，有如下體會(huì)：

1) 選材方面，在10月—11月份捕捉稻蝗品種，處于減數(shù)分裂相的細(xì)胞數(shù)目多，可以大大提高實(shí)驗(yàn)成功率。在開展減數(shù)分裂實(shí)驗(yàn)時(shí)，在體視鏡下將櫛比排列的精細(xì)小管撥開，有針對(duì)性的挑選后端膨大精細(xì)小管，挑取其中一條精細(xì)小管的后端膨大處(1/2)放在載玻片上觀察，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為明顯?；蚴侨?～3條的精細(xì)管小段一起看，注意小段之間分開些，避免壓片時(shí)的重疊，這樣可彌補(bǔ)多個(gè)分裂相不能在一張片子上觀察到的缺陷。

2) 在實(shí)驗(yàn)技術(shù)改進(jìn)方面，本次試驗(yàn)采用醋酸洋紅染液分步轉(zhuǎn)移染色，使染色充分，不會(huì)出現(xiàn)染色不深及染不上色的現(xiàn)象。在試驗(yàn)中也做過堿性品紅與醋酸洋紅的比較，前者染色快、深，染色體易觀察，但細(xì)節(jié)不易看清，并且試劑配制要經(jīng)約2周后才能染色力增強(qiáng)[9, 10]。后者著色較淺，但能看清細(xì)節(jié)，特別是細(xì)胞邊界狹隘處，和細(xì)胞重疊與否易于區(qū)分，后者當(dāng)天可用，可以更有效地提高染色體的固定效果。因此，選用醋酸洋紅染液分步轉(zhuǎn)移染色學(xué)生更易觀察到明顯的實(shí)驗(yàn)效果。染色時(shí)也可以直接在載玻片上染色，但要注意在染色過程中及時(shí)加染液以免材料干燥，如果染液邊界出現(xiàn)干燥，觀察時(shí)要換載玻片，以防影響觀片效果。

3) 關(guān)于壓片，經(jīng)常有學(xué)生由于壓片時(shí)滑動(dòng)玻片，導(dǎo)致顯微鏡下的細(xì)胞變形，使實(shí)驗(yàn)失敗。因此可以用左手拇指或食指壓住左側(cè)蓋玻片來幫助固定，然后再壓片。壓片后有時(shí)會(huì)有細(xì)胞重疊現(xiàn)象，一方面可用帶橡皮頭的鉛筆，用橡皮頭對(duì)準(zhǔn)材料處輕敲，使細(xì)胞分散；另一方面可以利用顯微鏡光圈，光照強(qiáng)度等方法來觀察細(xì)胞邊緣，來確定分裂時(shí)象。

4)材料保存期1年為佳，雖然2～3年的材料也能觀察到分裂相，但時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使精細(xì)管收縮，增加操作難度，特別對(duì)于學(xué)生經(jīng)驗(yàn)不足，操作不熟練的情況下，影響制片，觀察效果大打折扣。

5 結(jié)語(yǔ)

減數(shù)分裂實(shí)驗(yàn)中通過蝗蟲材料的合理化篩選，確定稻蝗品種為實(shí)驗(yàn)材料，并挑選2～3條后端膨大精細(xì)小管，選取后端膨大處(1/2)觀察，這是實(shí)驗(yàn)教學(xué)取得成功的基本保證。染色體制備過程通過醋酸洋紅染液分步轉(zhuǎn)移染色，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)成功率，使學(xué)生牢固掌握各個(gè)減數(shù)分裂時(shí)期染色體特征，深刻理解遺傳學(xué)基本定律。

參考文獻(xiàn):

[1]白 云, 韓秀玲, 王明艷. 減數(shù)分裂材料的選擇與壓片技術(shù)的改進(jìn)[J]. 華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 6(4): 32.

[2]朱蔚云, 梁敏儀. 蝗蟲減數(shù)分裂的實(shí)驗(yàn)[J]. 生物學(xué)雜志, 2003, 20(2): 50-52.

[3]龔玉新, 吳丹丹. 蝗蟲的減數(shù)分裂觀察[J]. 生物學(xué)通報(bào), 2008, 43(4): 60-62.

[4]陳 娟. 蝗蟲精巢減數(shù)分裂的制片與觀察[J]. 中國(guó)科技信息, 2006, (23): 184-185.

[5]周 暢. 蝗蟲精原細(xì)胞減數(shù)分裂實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)[J]. 生物學(xué)教學(xué), 1997, (12): 19.

[6]徐連城, 楊保謙. 蝗蟲精母細(xì)胞染色體制片法[J]. 遺傳, 1988, (2): 10.

[7]王金發(fā), 戚康標(biāo), 何炎明. 遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2008: 77-80.

[8]周耀紅, 周維鎬, 張 莉. “減數(shù)分裂”實(shí)驗(yàn)材料的探索[J]. 生物學(xué)教學(xué), 2006, 31(2): 52-53.

[9]郭善利, 劉林德. 遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 第2版. 北京: 科學(xué)出版社, 2010: 4-7.

[10]劉祖洞, 江紹慧. 遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 第2版. 北京: 高等教育出版社, 1999: 208-209.