老年與青年肺結(jié)核患者免疫功能差異的探討

段靜 侯超 毛源

老年與青年肺結(jié)核患者免疫功能差異的探討

段靜 侯超 毛源

目的探索老年肺結(jié)核患者與青年肺結(jié)核患者細(xì)胞免疫和體液免疫的各自特點(diǎn)以及兩者的差異和相關(guān)免疫指標(biāo)的臨床意義。方法檢測175例老年肺結(jié)核患者（老年組）和151例中青年肺結(jié)核患者（中青年組）免疫功能，并與50例健康人群（健康組）進(jìn)行比較分析。采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測肺結(jié)核患者和健康人群外周血CD3＋T細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞比率；采用免疫透射比濁法測定免疫球蛋白水平。結(jié)果老年組CD3＋、CD4＋細(xì)胞與中青年組和健康組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。中青年組CD4＋、CD8＋T細(xì)胞比率明顯高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。NK細(xì)胞老年組最高、健康組次之、中青年組最低，3組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。老年和中青年肺結(jié)核患者血清IgA均高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論中青年肺結(jié)核患者免疫功能明顯高于健康人群，免疫效應(yīng)細(xì)胞以CD4＋、CD8＋T細(xì)胞為主。老年肺結(jié)核患者的細(xì)胞免疫功能明顯低于健康人群，免疫效應(yīng)細(xì)胞以NK細(xì)胞為主。青年肺結(jié)核患者與老年肺結(jié)核患者在體液免疫功能方面無明顯差異。

肺結(jié)核；T淋巴細(xì)胞；細(xì)胞免疫；體液免疫

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis）感染引起的傳染病，也是單一致病菌感染引起死亡人數(shù)最多的疾病［1］。2010年我國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，結(jié)核病年發(fā)病患者數(shù)約為130萬，占全球發(fā)病的14.3%，居全球第2位［2］。所以在我國結(jié)核病的防治是一件非常重要的工作。結(jié)核分枝桿菌為胞內(nèi)寄生菌，故結(jié)核病免疫以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，淋巴細(xì)胞在結(jié)核免疫中起著重要作用，NK細(xì)胞在對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌的先天性免疫中也起著關(guān)鍵的作用［3］。盡管結(jié)核病激發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)是結(jié)核病最重要的免疫反應(yīng)，但許多實(shí)驗(yàn)也證明體液免疫的存在［4?5］。雖然大多數(shù)研究認(rèn)為結(jié)核桿菌感染后，機(jī)體會(huì)通過激活細(xì)胞免疫功能來抵抗結(jié)核桿菌的感染，但是由于年齡的差異，機(jī)體免疫激活的情況也不盡相同。目前對(duì)于結(jié)核病發(fā)病后患者免疫狀態(tài)變化的相關(guān)研究相對(duì)少見，患者發(fā)病之后免疫狀態(tài)的變化對(duì)其疾病的康復(fù)及整體機(jī)體狀態(tài)有著較大的影響，因此對(duì)其研究分析的價(jià)值仍然相對(duì)較高［6］。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測肺結(jié)核患者外周血T細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)率，采用免疫透射比濁法測定免疫球蛋白，來分析老年和中青年肺結(jié)核患者免疫功能改變的差異，進(jìn)而探討老年肺結(jié)核患者與青年肺結(jié)核患者細(xì)胞免疫和體液免疫的各自特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6月至2013年12月在我院住院并進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測的結(jié)核病患者326例，均符合結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、腫瘤、服用免疫抑制藥物及孕婦、哺乳期婦女。按年齡分為老年組和中青年組。其中中青年組151例，男87例，女64例，年齡18～59歲，平均（35±6）歲，老年組175例，男101例，女74例，年齡60～92歲，平均（65±4）歲，同時(shí)選擇我院同期健康體檢者50例作為對(duì)照組（健康組），男28例，女22例，年齡25～75歲，平均（50±5）歲。3組間一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器：德國PARTEC公司PAS流式細(xì)胞儀和美國BD公司提供的試劑盒，試劑A：CD45／CD14，異硫氰酸熒光素／PE熒光素（FITC／PE）；試劑B：MIgG1／MIgG1，F(xiàn)ITC／PE；試劑C：CD3／CD19，F(xiàn)ITC／PE；試劑D：CD3／CD4，F(xiàn)ITC／PE；試劑E：CD3／CD8，F(xiàn)ITC／PE；試劑F：CD3／CD16＋56，F(xiàn)ITC／PE；免疫球蛋白試劑盒由德賽診斷系統(tǒng)上海公司提供，采用日立7180生化分析儀檢測。

1.2.2 檢測方法：T細(xì)胞檢測方法：采集老年組、中青年組和健康組的靜脈血2 ml，EDTA抗凝。每份標(biāo)本用6只流式管，先分別對(duì)應(yīng)加入20μl試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E、試劑F，然后每份標(biāo)本的試管中準(zhǔn)確加入100μl抗凝全血，混勻，室溫，避光孵育20 min；每管加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫孵育10 min，至液體透明；1000 r／min離心5 min，棄上清；加入2 ml PBS洗液，1000 r／min離心5 min，棄上清；加入0.5 ml 1%甲醛溶液固定細(xì)胞，混勻，24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀分析，參考儀器說明書。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以s表示。2組間比較用Fisher精確概率法；多組間比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各種T細(xì)胞表達(dá)率的比較 CD3＋T細(xì)胞表達(dá)率：老年組明顯低于中青年組和健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中青年組與健康組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

CD4＋T細(xì)胞表達(dá)率：老年組明顯低于中青年組和健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中青年組明顯高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

CD8＋T細(xì)胞表達(dá)率：老年組與中青年組和健康組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中青年組明顯高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

NK細(xì)胞表達(dá)率：老年組高于中青年組和健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中青年組低于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 3組淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較（s，%）

表1 3組淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較（s，%）

注：與老年組比較，??P＜0.01；與中青年組比較，△△P＜0.01

組別CD3＋CD4＋CD8＋CD4＋／CD8＋NK老年組（n＝175）58.55±11.45 31.4±10.54 26.02±11.46 1.51±0.97 24.13±8.24中青年組（n＝151）73.61±7.46??41.84±7.29??29.23±7.20 1.60±0.76 11.68±5.36??健康組（n＝50）71.21±5.13??34.76±4.74??△△24.50±5.13△△1.65±0.51 16.57±8.33??△△

2.2 3組B細(xì)胞以及外周血IgA、IgG、IgM檢測結(jié)果

3組間B細(xì)胞、IgM和IgG表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。IgA表達(dá)率：老年組與健康組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中青年組與健康組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；老年組與中青年組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

3 討論

CD3分子分布于成熟的T淋巴細(xì)胞表面，其功能是激活T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。CD4分子主要分布于T淋巴細(xì)胞，也分布于胸腺細(xì)胞、某些B淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞表面，CD4＋T淋巴細(xì)胞的作用是分泌多種細(xì)胞因子而放大免疫反應(yīng)，屬于輔助性T淋巴細(xì)胞亞群?？紫槿鸬龋?］的研究中沒有區(qū)分結(jié)核病人的年齡，結(jié)果顯示結(jié)核病患者外周血CD3＋、CD4＋淋巴細(xì)胞表達(dá)率低于健康人。也就是說結(jié)核患者的免疫功能總體上低于健康人，免疫功能受到抑制或受損，這也可能是結(jié)核病患者患病的原因。而本研究發(fā)現(xiàn)中青年結(jié)核病患者外周血CD3＋、CD4＋淋巴細(xì)胞表達(dá)率高于健康組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說明并非所有的結(jié)核病患者的免疫功能在受到抑制或受損后都是不可調(diào)節(jié)或改變的，對(duì)于年輕患者而言，免疫器官和組織一般機(jī)能較好，可能因?yàn)槠凇⒏腥镜仍驅(qū)е旅庖吖δ艹霈F(xiàn)一過性或暫時(shí)性的減低，此時(shí)正因?yàn)楦腥玖私Y(jié)核桿菌從而激活了機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答來對(duì)抗結(jié)核桿菌的感染。而老年組患者外周血CD3＋、CD4＋淋巴細(xì)胞表達(dá)率顯著低于健康組，表明老年結(jié)核病患者免疫功能較健康人減低，可能是老年患者機(jī)體免疫器官和組織衰老機(jī)能降低，感染結(jié)核桿菌后經(jīng)過系統(tǒng)的免疫反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)之后也沒有激活機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

表2 3組B細(xì)胞以及外周血IgA、IgG、IgM檢測結(jié)果（s）

表2 3組B細(xì)胞以及外周血IgA、IgG、IgM檢測結(jié)果（s）

注：與健康組比較，??P＜0.01

組別B細(xì)胞（%）IgA（g／L）IgG（g／L）IgM（g／L）老年組（n＝175）13.37±7.49 3.03±1.64??12.47±3.39 1.15±0.51中青年組（n＝151）12.36±5.7 2.47±0.97??12.99±3.54 1.23±0.68健康組（n＝50）12.77±3.01 2.00±0.57??12.51±2.61 1.01±0.47

CD8＋T細(xì)胞可按功能再分為抑制性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞，前者通過釋放抑制性T細(xì)胞因子，抑制體液免疫和細(xì)胞免疫，發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用；后者則通過識(shí)別靶細(xì)胞膜表面MHC?Ⅰ類分子與抗原肽復(fù)合物，對(duì)抗原性靶細(xì)胞發(fā)揮直接的、特異性的殺傷作用［8］。王志剛等［5］研究顯示肺結(jié)核組外周血中CD8＋T細(xì)胞與健康組比較略有升高但差異無顯著性，提示結(jié)核桿菌感染后會(huì)刺激機(jī)體細(xì)胞免疫的激活。本研究結(jié)果顯示無論是老年結(jié)核病患者還是中青年結(jié)核病患者CD8＋T淋巴細(xì)胞均高于健康人群，和王志剛的研究結(jié)論一致，說明結(jié)核桿菌感染會(huì)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫的激活，結(jié)核病患者外周血CD8＋T淋巴細(xì)胞在抗結(jié)核保護(hù)中起一定作用。此外本研究中青年患者CD8＋T淋巴細(xì)胞表達(dá)要高于老年結(jié)核患者，表明老年結(jié)核病患者自身免疫系統(tǒng)激活產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞的能力減低。這種減低的情況可能有2種原因?qū)е?，第一是由于老年患者本身免疫器官的衰老?dǎo)致產(chǎn)生免疫效應(yīng)細(xì)胞的能力減低。結(jié)核桿菌感染機(jī)體后，機(jī)體為了對(duì)抗病菌的感染，激活細(xì)胞免疫對(duì)抗胞內(nèi)菌的感染，所以所有患者細(xì)胞免疫均會(huì)增強(qiáng)，但青年患者免疫器官和組織機(jī)能較好，而老年患者免疫器官和組織一般機(jī)能較差，所以導(dǎo)致細(xì)胞免疫的效應(yīng)CD8＋T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生減少。第二是由于CD4＋T淋巴細(xì)胞表達(dá)的情況在老年患者和青年患者中的表達(dá)差異導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞CD8＋T淋巴細(xì)胞表達(dá)不同。青年結(jié)核患者感染結(jié)核桿菌之后CD4＋T淋巴細(xì)胞的表達(dá)被激活，而老年結(jié)核患者感染結(jié)核桿菌之后CD4＋T淋巴細(xì)胞的表達(dá)未被激活。也就是說老年患者感染結(jié)核桿菌之后，免疫系統(tǒng)沒有激活，而青年患者免疫系統(tǒng)是被激活，所以老年患者的CD8＋T淋巴細(xì)胞表達(dá)低于青年患者。

NK細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中的一種顆粒狀物質(zhì)，它們參與同種異體移植排斥反應(yīng)，能夠殺傷變形和病毒微生物感染的細(xì)胞，人類的NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞一樣都含有粒溶素，這些小顆粒肽段顯示出有殺傷結(jié)核菌的性能，在穿孔素的作用下，粒溶素達(dá)到胞內(nèi)結(jié)核的部位［9］。NK細(xì)胞在結(jié)核病人中的表現(xiàn)情況報(bào)道各異，于春寶等［10］在對(duì)53例肺結(jié)核患者的研究中發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞在結(jié)核病人的不同患病類型表現(xiàn)出不同情況，NK細(xì)胞在初治組有輕微的降低，在復(fù)治組又有所上升，而在難治組的水平最低。而王志剛等［5］研究結(jié)果表明NK細(xì)胞在肺結(jié)核病人組及健康人中無顯著差異性。本研究結(jié)果顯示中青年組結(jié)核患者NK細(xì)胞表達(dá)率低于健康組，而老年組卻高于健康組，說明在對(duì)結(jié)核菌的殺傷過程中，老年患者主要是NK細(xì)胞發(fā)揮固有免疫的自然殺傷作用。其原因可能是老年患者感染結(jié)核桿菌之后，機(jī)體固有免疫首先發(fā)揮作用，NK細(xì)胞被激活。而年輕患者NK細(xì)胞被激活后，隨著CD4＋T淋巴細(xì)胞的激活，適應(yīng)性免疫應(yīng)答激活，細(xì)胞免疫效應(yīng)CD8＋T淋巴細(xì)胞被激活，為了避免過多的細(xì)胞及正常細(xì)胞被殺傷，免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)又抑制了NK細(xì)胞的活性，從而使NK細(xì)胞表達(dá)減少。

B細(xì)胞主要功能是介導(dǎo)體液免疫，在本研究中老年組、中青年組結(jié)核患者的B細(xì)胞表達(dá)率都與健康組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明肺結(jié)核患者免疫功能下降以細(xì)胞免疫受損為主，體液免疫受到影響較小。IgA是機(jī)體黏膜防御系統(tǒng)的主要成分，它抑制微生物在呼吸道上皮附著，具有抗菌、抗毒素和抗病毒作用。在本研究中，不同組群的IgA水平有差異，表明體液免疫在結(jié)核病人的免疫應(yīng)答過程也發(fā)揮一定的作用，機(jī)體的黏膜免疫系統(tǒng)是因?yàn)榻Y(jié)核桿菌的感染而激活。這與肺結(jié)核疾病是以空氣為媒介通過呼吸道傳播有密切的關(guān)系。

總之，本組研究顯示，老年肺結(jié)核患者和青年肺結(jié)核患者的免疫功能情況是有差異的，他們各自有不同的特點(diǎn)，青年肺結(jié)核患者細(xì)胞免疫功能明顯高于健康人群，免疫效應(yīng)細(xì)胞以CD4＋、CD8＋T細(xì)胞為主；老年肺結(jié)核患者的細(xì)胞免疫功能明顯低于健康人群，免疫效應(yīng)細(xì)胞以NK細(xì)胞為主；青年肺結(jié)核患者與老年肺結(jié)核患者在體液免疫中以IgA為主的黏膜防御系統(tǒng)是處于激活狀態(tài)的。這些特點(diǎn)提示在對(duì)這類患者應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑糾正和改善機(jī)體細(xì)胞免疫功能的異常時(shí)應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同年齡階段采取不同的免疫調(diào)節(jié)劑，只有這樣才能有利于病情的緩解和預(yù)后的改善。

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Differences in immune function between elderly and young patients w ith pulmonary tuberculosis

DUAN Jing，HOU Chao．Department of Laboratory，Nanjing Chest Hospital，Nanjing 210029，China；MAO Yuan．Nanjing kingmed Cli?nical Laboratory，Nanjing 210042，China

ObjectiveTo explore the differences of clinical characteristics in cells and humeral immunity between elderly and young patients with pulmonary tuberculosis，and to explore the clinical significance of the related immunity pa?rameters.MethodsThe immune function of 175 elderly and 151 young patients with pulmonary tuberculosis as well as 50 healthy person were analyzed and compared.Flow cytometry（FCM）was used to detect cell ratio of CD3＋T cells，CD4＋T cells，CD8＋T cells，NK cells and B cells，and the level of immunoglobulin was detected by immune nephelometry.Re?sultsThe levels of CD3＋T cells and CD4＋T cellswere lower in elderly group than those in young and healthy group（P＜0.01）.The levels of CD4＋T cells and CD8＋T cellswere significantly higher in young group than those in the healthy group（P＜0.01）.NK cells were highest in elderly group，followed by healthy group and young group，and the difference among the three groups were of statistical significance（P＜0.01）.Serum IgA of elderly group and young group were higher than that of healthy group（P＜0.01）.ConclusionsImmune function of young patientswith tuberculosis is significantly higher than healthy people，and CD4＋T cells and CD8＋T cells are themain immune cells.Cell immune function of elderly pa?tients with tuberculosis is significantly lower than healthy people，and themain immune cells are NK cells.There are no significant differences in the humoral immune function between young and elderly patientswith tuberculosis.

tuberculosis；T lymphocytes；cellular immunity；humoral immunity

R 521 ［

］ A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.11.018

2014?03?09）

210029江蘇省南京市，南京市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科（段靜，侯超）；210042江蘇省南京市，南京金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所（毛源）