石油污染土壤的生物降解實(shí)驗(yàn)*

石油污染土壤的生物降解實(shí)驗(yàn)*

李亞龍 楊琦 王士東 李博 張帆

中國(guó)地質(zhì)大學(xué)（北京）水資源與環(huán)境學(xué)院北京水資源與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

篩選石油污染土壤中的專一性降解萘菌株Rhodococcu與菲菌株Nocardioide，研究分離菌株對(duì)不同濃度下萘、菲的降解，并運(yùn)用抑制動(dòng)力學(xué)相關(guān)模型（Haldane模型）進(jìn)行模擬。菌株Rhodococcus降解萘?xí)r萘的最佳初始濃度為0.43mg/L，降解效率為96%，其菌株對(duì)低濃度萘的降解效果較為明顯；菌株Nocardioides降解菲時(shí)菲的最佳初始濃度為0.23mg/L，降解效率約為43%，其菌株對(duì)菲的降解效果不是很明顯，濃度梯度對(duì)其降解效率影響不大。對(duì)菌株Rhodococcus降解萘過(guò)程進(jìn)行Monod方程模擬相關(guān)系數(shù)達(dá)0.952，相關(guān)性良好；對(duì)菌株Nocardioides降解菲過(guò)程進(jìn)行Monod方程模擬相關(guān)系數(shù)為0.889，符合Monod方程。

土壤；抑制動(dòng)力學(xué)；萘、菲；降解；濃度

1 實(shí)驗(yàn)與方法

篩選石油污染土壤中的專一性降解萘菌株Rhodococcu與菲菌株Nocardioide，研究分離菌株對(duì)不同濃度下萘、菲的降解，并運(yùn)用抑制動(dòng)力學(xué)相關(guān)模型（Haldane模型）進(jìn)行模擬。

1.1 萘、菲測(cè)定方法

以高效液相色譜定量測(cè)定萘、菲濃度，色譜柱為C—18反相色譜柱，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流動(dòng)相為甲醇∶水=90∶10，以1.0mL/min的流速等度淋洗。

1.2 降解實(shí)驗(yàn)

向無(wú)菌的550mL血清瓶中加入少量萘—丙酮或菲—丙酮儲(chǔ)備液，待丙酮揮發(fā)掉后向其中加入無(wú)菌無(wú)機(jī)鹽，調(diào)節(jié)pH值。迅速封住瓶口，將血清瓶放入150r/min的搖床中，振蕩一段時(shí)間，以使反應(yīng)瓶?jī)?nèi)溫度達(dá)到預(yù)定值，并使萘、菲充分溶解。取出血清瓶，分別加入菌株Rhodococcus和菌株Nocardioides菌懸液5mL，使溶液總體積為550mL。迅速封住瓶口，開(kāi)始計(jì)時(shí)，并將反應(yīng)瓶放回30℃、150r/min的搖床中，取樣時(shí)間分別為0、0.5、2、4、8、12和24h。樣品經(jīng)0.45μm聚四氟乙烯濾膜過(guò)濾后分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種特征和鑒定

兩種菌株30℃恒溫培養(yǎng)8d后，觀察固體培養(yǎng)基上各菌落的大小、顏色、透明度等形態(tài)，對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)并記錄其菌落特征，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌落特征

圖1 菌株在不同pH值下對(duì)萘、菲的降解

分別對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果顯示菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌。

2.2 菌對(duì)萘、菲的降解

（1）實(shí)驗(yàn)pH值及溫度的選定。初始萘濃度為24mg/L，初始菲濃度為0.6mg/L，菌懸液接種量為1%（5mL/550mL）時(shí)，研究了不同初始pH值和不同溫度狀況下降解菌對(duì)萘、菲的影響，不同初始pH值和溫度條件下萘、菲降解菌的降解曲線見(jiàn)圖1、圖2。萘、菲降解菌在pH值為4～10范圍內(nèi)均可降解目標(biāo)底物，但降解效果隨pH值的升高先增加后降低，萘、菲降解菌在pH值分別為8和7時(shí)達(dá)到最大降解率。溫度的變化對(duì)萘、菲降解菌降解萘的影響較大，反應(yīng)24h后，15℃時(shí)的萘、菲去除率僅為29.3%和23.0%，而30℃時(shí)萘、菲去除率則高達(dá)86.6%和98.4%，在30℃時(shí)降解效果最佳。綜上所述，確定后續(xù)的實(shí)驗(yàn)溫度為30℃，萘、菲降解菌pH值分別為8和7。

圖2 菌株在不同溫度下對(duì)萘、菲的降解

（2）初始濃度對(duì)于萘降解菌的影響。從菌株Rhodococcus在不同萘初始濃度下對(duì)萘的降解曲線可以看出，當(dāng)初始濃度為0.43mg/L時(shí)，菌株Rhodococcus對(duì)萘的降解效果最為理想，在24h內(nèi)降解率為96%。這說(shuō)明菌株Rhodococcus對(duì)低濃度萘的降解效率較高。實(shí)驗(yàn)中，除了在萘初始濃度為27.10mg/L時(shí)24h降解率較差（30%），其他幾個(gè)濃度梯度均達(dá)到40%以上。存在高初始濃度萘降解效率低的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，可能是在高濃度下萘與菌體內(nèi)的酶底物復(fù)合物結(jié)合生成不具有催化反應(yīng)活性并且不能進(jìn)一步分解的三元復(fù)合物，從而降低了降解效率。12h后降解效果明顯，可能是細(xì)菌的生長(zhǎng)進(jìn)入了對(duì)數(shù)期，細(xì)菌濃度增大從而使降解效率有了明顯的提高。

（3）初始濃度對(duì)于菲降解菌的影響。由菌株Nocardioides在不同菲初始濃度下對(duì)菲的降解曲線可看出，在24h內(nèi)菌株Nocardioides對(duì)菲的降解效率不是很高，在初始濃度為0.23mg/L時(shí)處理效果最好，降解率為43%。在初始濃度為0.79mg/L時(shí)效果最差，24h降解率為26%，考慮高濃度的菲對(duì)該菌株產(chǎn)生抑制。在對(duì)菲的降解過(guò)程中，降解隨時(shí)間波動(dòng)較大，但各初始濃度下反應(yīng)在0.5h處降解效率較高，0.5h后降解波動(dòng)較大[1-3]。

2.3 Haldane方程模擬

采用Monod模型進(jìn)行模擬，以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)做圖進(jìn)行線性回歸分析，得出最大降解速率vmax和飽和常數(shù)Ks值。

兩株菌株的Monde方程相關(guān)系數(shù)分別為0.952和0.889，符合Monde方程。以Haledan方程得出萘、菲降解菌方程常數(shù)分別為：vmax=0.016min-1，Ks=5.54mg/L，Ki=89.27mg/L；vmax=0.0054min-1，Ks=0.26mg/L，Ki=2.01mg/L。萘降解菌株Rhodococcus和菲降解菌株Nocardioides的Haledane方程分別為

半飽和常數(shù)反映的是微生物對(duì)污染物的親和系數(shù)。萘的半飽和常數(shù)（5.54mg/L）要大于菲的半飽和常數(shù)（0.26mg/L），可見(jiàn)菌株Rhodococcus對(duì)萘的親和力要大于菌株Nocardioides對(duì)菲的親和力，這也與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[4]。本實(shí)驗(yàn)中萘的抑制常數(shù)（89.27mg/L）要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于菲的抑制常數(shù)（2.01mg/L），這說(shuō)明萘對(duì)菌株Rhodococcus的抑制作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于菲對(duì)菌株Nocardioides的抑制作用。

3 結(jié)論

（1）在本實(shí)驗(yàn)研究濃度范圍內(nèi)，菌株Rhodococcus降解萘?xí)r萘的最佳初始濃度為0.43mg/L，此時(shí)降解效率為96%，且菌株對(duì)低濃度萘的降解效果較為明顯；菌株Nocardioides降解菲時(shí)菲的最佳初始濃度為0.23mg/L，此時(shí)降解效率約為43%，菌株對(duì)菲的降解效果不是很明顯，濃度梯度對(duì)其降解效率影響不大。

（2）對(duì)菌株Rhodococcus降解萘過(guò)程進(jìn)行Monod方程模擬相關(guān)系數(shù)達(dá)0.952，相關(guān)性良好；對(duì)菌株Nocardioides降解菲過(guò)程進(jìn)行Monod方程模擬相關(guān)系數(shù)為0.889，符合Monod方程。

[1]郭陰，鄧國(guó)志，張小凡，等．壬基酚降解菌株的降解特性[J]．凈水技術(shù)，2011，30（3）：27.

[2]毛莉，唐玉斌，陳芳艷，等．難降解有機(jī)物污染水體微生物修復(fù)研究進(jìn)展[J]．凈水技術(shù)，2007，26（1）：36.

[3]張丹，李兆格，包新光，等．細(xì)菌降解萘、菲的代謝途徑及相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J]．生物工程學(xué)報(bào)，2010，26（6）：726-734.

[4]白智勇，李博，楊琦，兩株菌對(duì)萘的降解特性對(duì)比[J]．油氣田地面工程，2013，32（3）：48-49.

（欄目主持 楊軍）

10.3969/j.issn.1006-6896.2014.10.013

基金論文：重點(diǎn)防控重金屬汞、鉻、鉛、鎘、砷便攜/車載/在線監(jiān)測(cè)儀器開(kāi)發(fā)與應(yīng)用示范（2012YQ060115）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2652013101、2652013086、2652013087）資助。