洋蔥假單胞菌產(chǎn)脂肪酶條件的優(yōu)化

王旭愿+張敏+李成濤+沈穎輝+武晶

摘要：采用Rashid N p-nPP比色法，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基主要成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高聚丁二酸丁二醇酯（PBS）的生物降解速率。結(jié)果表明，該菌種產(chǎn)脂肪酶的最適培養(yǎng)基為菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化劑Tween-60 2.5 g/L，培養(yǎng)基初始pH 8.0；最適培養(yǎng)條件為接種量9%，培養(yǎng)溫度35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速130 r/min，培養(yǎng)時(shí)間3 d。在此優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，洋蔥假單胞菌產(chǎn)脂肪酶活性可達(dá)32.935 U/mL。

關(guān)鍵詞：洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）；聚丁二酸丁二醇酯（PBS）；脂肪酶；優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.11+2；TQ925+.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）01-0184-04

Optimization of Production Conditions of the Lipase from Pseudomonas cepacia

WANG Xu-yuan，ZHANG Min，LI Cheng-tao，SHEN Ying-hui，WU Jing

（Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry， Ministry of Education， Shaanxi University of Science & Technology， Xian 710021， China）

Abstract： The colorimetric method of Rashid N p-nPP was used， and single factor and orthogonal experiments were applied to optimize the fermentation medium and culture conditions of Pseudomonas cepacia， in order to improve the production of lipase to improve the biodegradation rate of poly（butylene succinate）（PBS）. The results showed that the optimum medium contained 5.0 g/L rapeseed oil， 0.5 g/L yeast extract， 2.5 g/L emulsifier Tween-60， with the initial pH 8.0. The optimum culture conditions were 9% inoculation， culture temperature 35 ℃， shake rotation 130 r/min and culturing length 3 days. Under the optimum conditions， the lipase from Pseudomonas cepacia could reach 32.935 U/mL.

Key words： Pseudomonas cepacia； poly butylenes succinate （PBS）； lipase； optimization

收稿日期：2013-05-10

基金項(xiàng)目：陜西科技大學(xué)創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目（TD10-01）；陜西科技大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：王旭愿（1990-），女，陜西西安人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锝到飧叻肿硬牧希娫?huà)）15309242538（電子信箱）

xuyuanguo15@163.com。

眾所周知，大多數(shù)的傳統(tǒng)塑料難以降解，且不易回收利用，其造成的環(huán)境污染引起了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注[1，2]。因此，人們投入了大量的精力去研究開(kāi)發(fā)可生物降解的環(huán)境友好型材料，聚丁二酸丁二醇酯（PBS）具有良好的生物降解性和力學(xué)性能，因而受到了極大的關(guān)注[3-6]。PBS廢棄后，在土壤微生物的作用下，可降解為低分子量物質(zhì)，最終降解為對(duì)環(huán)境無(wú)污染的CO2和H2O[7]。在PBS的生物降解過(guò)程中，雖然其行為是由微生物主導(dǎo)，但直接起降解作用的是微生物代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的脂肪酶，即在脂肪酶的作用下，PBS主鏈中的酯鍵發(fā)生水解斷裂進(jìn)而發(fā)生降解[8]。因此，提高微生物代謝生產(chǎn)脂肪酶的能力對(duì)于促進(jìn)PBS降解，提高PBS降解速度有著十分重要的作用。

本研究是從洋蔥假單胞菌出發(fā)，對(duì)1株代謝脂肪酶的菌株進(jìn)行了培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化，以提高其可降解PBS脂肪酶的代謝產(chǎn)量和活力，為后續(xù)微生物降解PBS基共聚物的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

試驗(yàn)于2012年12月至2013年3月在陜西科技大學(xué)教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）由本實(shí)驗(yàn)室自主分離篩選并鑒定保存。

1.2 培養(yǎng)基

菌種保存培養(yǎng)基：牛肉膏 0.3 g、蛋白胨 0.5 g、NaCl 0.5 g、瓊脂2 g、蒸餾水100 mL、pH 7.0。

菌種活化培養(yǎng)基：牛肉膏 0.3 g、蛋白胨 0.5 g、NaCl 0.5 g、蒸餾水 100 mL、pH 7.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：菜子油 1 g、（NH4）2SO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、KH2PO4 0.05 g、K2HPO4 0.05 g、蒸餾水 100 mL、pH 8.0。培養(yǎng)基于121 ℃下滅菌20 min備用。

將洋蔥假單胞菌菌種接種到斜面保存培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用接種環(huán)挑取菌體接于活化培養(yǎng)基中，置于35 ℃，130 r/min搖床上培養(yǎng)24 h后，按6%接種量接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在250 mL錐形瓶中裝100 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，在同樣條件下培養(yǎng)48 h。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶活性的測(cè)定 以酶活力為檢測(cè)指標(biāo)，將培養(yǎng)48 h后的發(fā)酵液于3 000 r/min下冷凍離心分離12 min，除去菌體，取其上層清液即粗酶液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩２捎肦ashid N p-nPP比色法[9]測(cè)定發(fā)酵液中脂肪酶的活性。在上述條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位（U）。

1.3.2 洋蔥假單胞菌產(chǎn)酶條件的單因素試驗(yàn) 從基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基出發(fā)，研究不同碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、乳化劑及乳化劑含量對(duì)洋蔥假單胞菌產(chǎn)脂肪酶的影響，并對(duì)其進(jìn)行分析比較。

1.3.3 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基各組分，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見(jiàn)表1。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇接種量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時(shí)間這4個(gè)發(fā)酵影響因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同碳源對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 假單胞菌能利用的碳源種類(lèi)很多[10]，本試驗(yàn)中選取了7種物質(zhì)分別作為發(fā)酵培養(yǎng)基的惟一碳源。如圖1所示，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的最適碳源為菜子油，以菜子油為碳源時(shí)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性最高，并且在3組平行試驗(yàn)中，脂肪酶活性相差不大，說(shuō)明以菜子油為碳源時(shí)洋蔥假單胞菌產(chǎn)酶量及酶活性較高且相對(duì)穩(wěn)定，所以確定采用菜子油作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

2.1.2 不同氮源對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 氮素對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要意義，微生物利用氮素在細(xì)胞內(nèi)合成氨基酸和堿基，進(jìn)而合成蛋白質(zhì)、核酸等細(xì)胞成分[10]。從圖2可以看出，以酵母膏為氮源時(shí)，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性最高，而其他7種物質(zhì)作為氮源時(shí)，酶活性均低于酵母膏為氮源時(shí)的酶活性，所以采用酵母膏作為洋蔥假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.1.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 培養(yǎng)溫度的變化能夠影響微生物體內(nèi)許多生化反應(yīng)，從圖3中可以看出，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性隨溫度的升高呈先增加后減小的趨勢(shì)，在培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí)脂肪酶活性達(dá)到最高。說(shuō)明在培養(yǎng)溫度較低時(shí)，微生物生長(zhǎng)緩慢，其新陳代謝作用所分泌的胞外脂肪酶量較小，而當(dāng)培養(yǎng)溫度高于最適培養(yǎng)溫度時(shí)，微生物細(xì)胞功能急劇下降，易于衰老和死亡。

2.1.4 不同培養(yǎng)基初始pH對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 環(huán)境的酸堿度與微生物的代謝生長(zhǎng)和產(chǎn)酶關(guān)系密切，pH影響微生物原生質(zhì)膜所帶電荷的極性和滲透性等。由圖4可知，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性隨pH的增大呈先增加后減小的趨勢(shì)，且在培養(yǎng)基pH為8.5時(shí)活性達(dá)到最高。由此可知，洋蔥假單胞菌代謝的脂肪酶為堿性脂肪酶，這與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相符[11，12]。

2.1.5 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 搖床轉(zhuǎn)速的大小直接關(guān)系到發(fā)酵液溶氧量的多少，氧含量是影響微生物生長(zhǎng)的因素之一，不同的微生物對(duì)氧的需求量不同。如圖 5所示，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性在搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)活性最高，并且在3次平行試驗(yàn)中，脂肪酶活性相差不大，故其最適搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min。隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性呈先增加后減小的趨勢(shì)。說(shuō)明轉(zhuǎn)速過(guò)低時(shí)，通氣量小，影響菌體的生長(zhǎng)繁殖，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以被有效利用，而當(dāng)轉(zhuǎn)速過(guò)高時(shí)，通氣量又太大，生長(zhǎng)繁殖過(guò)快，菌體易過(guò)早進(jìn)入死亡期，產(chǎn)生的脂肪酶較少，因此脂肪酶活性差。

2.1.6 不同接種量對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 接種量和培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)程的延緩期長(zhǎng)短呈反比[13]，一般工業(yè)上會(huì)采用較大的接種量來(lái)縮短延緩期。增加接種量，實(shí)際上是利用生物的一種群體效應(yīng)，即通過(guò)種內(nèi)的相互關(guān)系（如種內(nèi)互助），使之更快地適應(yīng)新環(huán)境，縮短生長(zhǎng)過(guò)程的延緩期，從而縮短發(fā)酵周期。如圖6所示，隨著發(fā)酵瓶中接種量的增大，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性呈先增加后減小的趨勢(shì)。洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性在接種量為9%時(shí)最高。在接種量較小時(shí)，微生物發(fā)酵周期較長(zhǎng)，脂肪酶的產(chǎn)率較低；當(dāng)接種量高于最適接種量時(shí)，菌絲密集，空間與資源相對(duì)匱乏，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿(mǎn)足菌體的生長(zhǎng)需要，導(dǎo)致菌體代謝過(guò)程受阻，從而不利于微生物發(fā)酵產(chǎn)酶。

2.1.7 不同乳化劑對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 乳化劑即表面活性劑，可以改善微生物細(xì)胞膜的通透性，使脂肪酶易于分泌到細(xì)胞外[11]，因此合適的乳化劑可提高生物的產(chǎn)酶量。從圖7中可以看出，不同乳化劑對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的影響不同。向洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的培養(yǎng)體系中分別添加Tween-60、Tween-80、明膠、Trinton X-100、阿拉伯膠、橄欖油乳化劑及Tween-60與Span-80按質(zhì)量比1∶1復(fù)配而成的乳化劑時(shí)，可以不同程度地使脂肪酶活性增加且更加穩(wěn)定，其中Tween-60對(duì)其促進(jìn)作用最大。添加Span-80和十二烷基磺酸鈉時(shí)，對(duì)脂肪酶則表現(xiàn)為抑制作用。

2.1.8 乳化劑含量對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的非離子表面活性劑Tween-60來(lái)提高細(xì)胞膜的通透性，如圖8所示，在一定范圍內(nèi)添加乳化劑Tween-60，脂肪酶活性比未添加的對(duì)照有較大的提高。當(dāng)添加量低于0.30%時(shí)，脂肪酶活性隨添加量質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而提高，在0.30%時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)繼續(xù)加大Tween-60用量時(shí)，脂肪酶活性開(kāi)始出現(xiàn)下降，這可能是大劑量的Tween-60對(duì)菌體產(chǎn)生了一定的毒害，影響微生物的正常代謝活動(dòng)及產(chǎn)酶。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇菜子油為碳源，酵母膏為氮源，Tween-60為乳化劑，培養(yǎng)基正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的因素從大到小依次是A、C、B、D，即作為碳源的菜籽油對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性影響最大，其次是乳化劑，培養(yǎng)基初始pH影響最小，最優(yōu)組合為A1B1C1D1，即菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化劑Tween-60 2.5 g/L，培養(yǎng)基初始pH 8.0。

2.2.2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。通過(guò)直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的因素從大到小依次是H、E、G、F，即培養(yǎng)時(shí)間對(duì)脂肪酶活性影響最大，接種量次之，培養(yǎng)溫度對(duì)酶活性的影響最小，所以選擇脂肪酶活性最高的培養(yǎng)條件為接種量9%，培養(yǎng)溫度35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速130 r/min，培養(yǎng)時(shí)間3 d，即E2F2G1H1。

3 小結(jié)

以洋蔥假單胞菌為出發(fā)菌株，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，得到洋蔥假單胞菌生產(chǎn)脂肪酶的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為菜子油5.0 g/L、酵母膏0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、乳化劑Tween-60 2.5 g/L，pH 8.0。最佳培養(yǎng)條件為接種量9%、培養(yǎng)溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速130 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)3 d。在此條件下，脂肪酶活性可達(dá)32.935 U/mL。同時(shí)，從發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)脂肪酶活力影響不大，但培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致部分菌體絲自溶，培養(yǎng)基變黏稠，不利于脂肪酶的產(chǎn)生。

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（責(zé)任編輯 趙 娟）

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇菜子油為碳源，酵母膏為氮源，Tween-60為乳化劑，培養(yǎng)基正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的因素從大到小依次是A、C、B、D，即作為碳源的菜籽油對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性影響最大，其次是乳化劑，培養(yǎng)基初始pH影響最小，最優(yōu)組合為A1B1C1D1，即菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化劑Tween-60 2.5 g/L，培養(yǎng)基初始pH 8.0。

2.2.2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。通過(guò)直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的因素從大到小依次是H、E、G、F，即培養(yǎng)時(shí)間對(duì)脂肪酶活性影響最大，接種量次之，培養(yǎng)溫度對(duì)酶活性的影響最小，所以選擇脂肪酶活性最高的培養(yǎng)條件為接種量9%，培養(yǎng)溫度35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速130 r/min，培養(yǎng)時(shí)間3 d，即E2F2G1H1。

3 小結(jié)

以洋蔥假單胞菌為出發(fā)菌株，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，得到洋蔥假單胞菌生產(chǎn)脂肪酶的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為菜子油5.0 g/L、酵母膏0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、乳化劑Tween-60 2.5 g/L，pH 8.0。最佳培養(yǎng)條件為接種量9%、培養(yǎng)溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速130 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)3 d。在此條件下，脂肪酶活性可達(dá)32.935 U/mL。同時(shí)，從發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)脂肪酶活力影響不大，但培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致部分菌體絲自溶，培養(yǎng)基變黏稠，不利于脂肪酶的產(chǎn)生。

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（責(zé)任編輯 趙 娟）

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇菜子油為碳源，酵母膏為氮源，Tween-60為乳化劑，培養(yǎng)基正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的因素從大到小依次是A、C、B、D，即作為碳源的菜籽油對(duì)洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性影響最大，其次是乳化劑，培養(yǎng)基初始pH影響最小，最優(yōu)組合為A1B1C1D1，即菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化劑Tween-60 2.5 g/L，培養(yǎng)基初始pH 8.0。

2.2.2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。通過(guò)直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的因素從大到小依次是H、E、G、F，即培養(yǎng)時(shí)間對(duì)脂肪酶活性影響最大，接種量次之，培養(yǎng)溫度對(duì)酶活性的影響最小，所以選擇脂肪酶活性最高的培養(yǎng)條件為接種量9%，培養(yǎng)溫度35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速130 r/min，培養(yǎng)時(shí)間3 d，即E2F2G1H1。

3 小結(jié)

以洋蔥假單胞菌為出發(fā)菌株，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，得到洋蔥假單胞菌生產(chǎn)脂肪酶的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為菜子油5.0 g/L、酵母膏0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、乳化劑Tween-60 2.5 g/L，pH 8.0。最佳培養(yǎng)條件為接種量9%、培養(yǎng)溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速130 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)3 d。在此條件下，脂肪酶活性可達(dá)32.935 U/mL。同時(shí)，從發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)脂肪酶活力影響不大，但培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致部分菌體絲自溶，培養(yǎng)基變黏稠，不利于脂肪酶的產(chǎn)生。

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（責(zé)任編輯 趙 娟）