孵化基質(zhì)pH對紅耳龜和中華條頸龜孵化及血液生理指標(biāo)的影響

李燕華+傅麗容+史海濤

摘要：為了探討土壤酸化對紅耳龜（Trachemys scripta elegans）和中華條頸龜（Mauremys sinensis）孵化及稚龜血液生理指標(biāo)的影響，在孵化溫度為（30±0.5） ℃，孵化基質(zhì)pH分別為4、5、6、7的條件下，對比研究了兩種龜卵孵化率、畸形率、孵化期和血液生理指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，兩種龜卵孵化率均隨孵化基質(zhì)pH的降低而降低，pH為4時(shí)可使胚胎致死，pH為7、6、5處理同種龜不同處理間和同種處理不同種之間孵化率差異不顯著（P>0.05）；pH降低紅耳龜孵化期縮短，胚胎發(fā)育加速，胚胎發(fā)育正常，而中華條頸龜畸形率升高（P<0.05）；兩種稚龜血細(xì)胞變化不同，紅耳龜紅細(xì)胞長、短徑變長，長短徑比增加，紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05），中華條頸龜各項(xiàng)血液生理指標(biāo)差異不顯著。對比研究各項(xiàng)指標(biāo)可知，紅耳龜通過減少畸形率、提高急性應(yīng)激刺激閾值，增強(qiáng)了對酸脅迫的耐受性。

關(guān)鍵詞：紅耳龜（Trachemys scripta elegans）；中華條頸龜（Maurenmys sinensis）；酸堿度；孵化；血細(xì)胞

中圖分類號：Q959.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0149-04

Effect of Hatching Matrix pH on Hatching and Blood Physiological Indexes of Trachemys scripta elegans and Mauremys sinensis

LI Yan-hua，F(xiàn)u Li-rong，SHI Hai-tao

（College of Life Sciences， Hainan Normal University， Haikou 571158， China）

Abstract： In order to explore the effects of soil acidification on egg hatching and baby blood physiological indexes of Trachemys scripta elegans and Mauremys sinensis， the experiment incubation temperature was（30±0.5） ℃，and pH of incubation matrix was 4， 5， 6， 7. Under these conditions， hatching rate， deformity rate， incubation period and blood physiological changes of the turtle eggs of both species were compared. The results showed that hatching rates of both species decreased as pH of hatching matrix decreased， and embryos were dead when pH was 4. There were no significant differences among turtles in different treatments of the same species and the same treatments of different species in condition of pH 5， 6， 7（P>0.05）； When pH decreased， hatching period of Trachemys scripta shortened， their embryos， growth accelerated in normal order while， deformity rate of Mauremys sinensis increased（P<0.05）. Blood cells of the two baby turtles changed differently. Both length-diameter and short diameter of Trachemys scripta elegans red cell became longer， ratio of length-diameter and short diameter increased， and the quantity of red cell and white cell increased significantly（P<0.05）. The comparative study of these indicators showed that trachemys scripta elegans enhanced tolerance to acid stress through reducing deformity rate and improving threshold of acute stress stimulation.

Key words： Trachemys scripta elegans； Mauremys sinensis； pH； hatching； blood cell

收稿日期：2013-07-16

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金國際地區(qū)重大合作項(xiàng)目（30910103916）；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（310040）

作者簡介：李燕華（1983-），女，河北邯鄲人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事動物生理研究，（電話）18789086177（電子信箱）green.wudi@163.com；

通訊作者，傅麗容（1964-），女，教授，主要從事動物繁殖生理研究，（電子信箱）flr@hainnu.edu.cn；史海濤（1963-），男，教授，博士，

主要從事兩棲爬行動物生態(tài)學(xué)與保護(hù)生物學(xué)研究，（電子信箱）haitao-shi@263.net。

酸雨現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅世界環(huán)境的十大問題之一[1]，國內(nèi)外許多學(xué)者的大量研究結(jié)果表明，酸雨對地球和脆弱的生態(tài)系統(tǒng)（包括海洋生態(tài)系統(tǒng)）造成了嚴(yán)重的威脅[2，3]。血液作為衡量動物體對環(huán)境適應(yīng)狀況、健康以及營養(yǎng)狀況重要指標(biāo)，在環(huán)境脅迫下變化尤其明顯[4]。研究表明pH的下降能使魚類血液紅細(xì)胞載氧能力隨之減弱[5]；影響膜蛋白的功能，使紅細(xì)胞脆性增大，更易破裂[5]；還會抑制鯉魚鰓組織酶活力，使體重下降[6]。酸雨造成的土壤酸化對土壤動物的生存也造成嚴(yán)重的威脅[7，8]，Marco等[9]對蜥蜴（Pogonu vitticeps）的研究表明，土壤pH的改變可能影響到卵與周圍環(huán)境的水分和氣體交換，或者直接改變卵內(nèi)部的pH，最終影響到胚胎發(fā)育。而胚胎發(fā)育是動物生活史中的重要時(shí)期，也是對生態(tài)因子最敏感的時(shí)期[10]。龜鱉類動物卵生且無護(hù)卵行為，體外自然孵化，環(huán)境因子對孵化具有更大的影響[10]。所以，酸雨所導(dǎo)致的土壤酸化對龜鱉類動物在胚胎發(fā)育期的毒害作用不可忽視。

紅耳龜（Trachemys scripta elegans）列為世界最危險(xiǎn)的100個(gè)外來入侵物種之一[11]，其適應(yīng)力強(qiáng)、生長速度快、高繁殖、易存活，與本地土著龜——中華條頸龜（Maurenmys sinensis）具有相似的生態(tài)位[12]，在野外情況下可存在于相同生境中[13]。當(dāng)面臨日益嚴(yán)重的酸雨所導(dǎo)致的土壤酸化脅迫時(shí)，處于胚胎發(fā)育期的兩種龜對環(huán)境脅迫的耐受性及適應(yīng)能力如何，目前還未見相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)?zāi)M了土壤酸化對紅耳龜和中華條頸龜?shù)呐咛テ谠斐擅{迫，通過對比研究檢測兩種龜孵化和稚龜血液指標(biāo)變化，探討紅耳龜和中華條頸龜對酸性環(huán)境的耐受性，從生理學(xué)角度分析紅耳龜入侵的機(jī)制，對防止紅耳龜?shù)娜肭志哂幸欢ǖ闹笇?dǎo)意義，為保護(hù)物種多樣性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用紅耳龜與中華條頸龜卵各120枚，2011年4月9日購自海南省文昌順利農(nóng)漁科技公司，胚盤明顯，發(fā)育正常。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用蛭石孵化基質(zhì)，以0.1 mol/L HCl調(diào)制蛭石，設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)濃度組，試驗(yàn)組pH分別為4、5、6，對照組pH為7。將紅耳龜與中華條頸龜卵各隨機(jī)分成4組，每組30枚，置于智能生化培養(yǎng)箱中孵化。1周后剔除未受精卵，孵化溫度保持在（30.0±0.5） ℃，空氣相對濕度為85%，每日用IQ150土壤原位pH計(jì)測定孵化基質(zhì)pH并做相應(yīng)的調(diào)節(jié)，以保證孵化盒內(nèi)基質(zhì)pH的恒定。

1.3 孵化指標(biāo)和血液生理指標(biāo)檢測

記錄每只龜卵的孵化時(shí)間，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算不同pH處理龜卵的孵化率、畸形率和孵化期。稚龜孵出24 h后進(jìn)行血液生理指標(biāo)的檢測，包括血細(xì)胞計(jì)數(shù)和常規(guī)血涂片制作。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)利用Excel 2003和SPSS 16.0進(jìn)行處理，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±SD表示。（1）Kruskal-Wallis多獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)和χ2-檢驗(yàn)不同pH處理對胚胎孵化率、畸形率的影響和血細(xì)胞數(shù)量變化；（2）方差分析（ANOVA）結(jié)合LSD法，檢驗(yàn)不同孵化基質(zhì)pH對胚胎孵化期的影響和血細(xì)胞形態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)pH對兩種龜卵孵化率、畸形率和孵化期的影響

由表1可知，pH 4組的兩種龜卵孵化率均為0，pH 7、pH 6、pH 5組隨著pH的降低，兩種龜卵孵化率均呈下降趨勢，經(jīng)Kruskal-Wallis多獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)差異不顯著（χ2=2.01，df=1，P>0.05；χ2=0.13，df=1，P>0.05）。相同pH下，紅耳龜孵化率低于中華條頸龜，差異不顯著（P>0.05），說明孵化基質(zhì)pH在一定范圍內(nèi)對稚龜胚胎發(fā)育有一定影響，過低的pH可使胚胎致死。

不同的pH處理，紅耳龜發(fā)育正常，中華條頸龜出現(xiàn)畸形龜，畸形率隨pH降低呈升高趨勢。pH 5組，中華條頸龜畸形率極顯著高于紅耳龜（P<0.01）。紅耳龜與中華條頸龜均表現(xiàn)出隨pH降低，孵化期縮短。紅耳龜孵化期pH 5組顯著短于pH 7、pH 6組（P<0.05），中華條頸龜各組間差異不顯著（P>0.05），說明低pH可縮短孵化期，影響紅耳龜胚胎的發(fā)育速度。

2.2 基質(zhì)pH對孵化稚龜血細(xì)胞形態(tài)的影響

測定兩種稚龜紅細(xì)胞長短徑比，比較不同孵化基質(zhì)pH處理下紅細(xì)胞形態(tài)的變化（表2）。單因素方差分析表明，不同pH處理紅耳龜稚龜紅細(xì)胞形態(tài)差異顯著（P<0.05）。紅耳龜稚龜pH 5組紅細(xì)胞長短徑比為1.72±0.19，顯著高于pH 6組1.64±0.17和pH 7組1.59±0.14，并表現(xiàn)出隨pH降低，長短徑比逐漸增大的規(guī)律。中華條頸龜稚龜紅細(xì)胞長短徑比差異不顯著（P>0.05），形態(tài)差異不明顯（P>0.05）。

2.3 基質(zhì)pH對孵化稚龜血細(xì)胞數(shù)量的影響

孵化基質(zhì)pH顯著影響紅耳龜稚龜紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量見表3。pH 7、pH 6、pH 5組紅細(xì)胞數(shù)分別為（5.65±0.69）×1011、（6.36±0.99）×1011、（6.86±1.33）×1011個(gè)/L，隨pH降低，紅細(xì)胞數(shù)增多，且紅細(xì)胞形態(tài)變化一致；白細(xì)胞數(shù)量隨pH降低而增多，分別為（7.48±1.19）×109、（7.56±0.88）×109、（8.23±1.11）×109個(gè)/L。中華條頸龜稚龜?shù)募t細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量變化不明顯（P>0.05）。

兩種稚龜血涂片觀察均可見嗜中性、嗜酸性、嗜堿性、單核和淋巴5類白細(xì)胞。不同pH處理白細(xì)胞數(shù)量的不同主要表現(xiàn)在不同種類的白細(xì)胞所占的比例不同。低pH處理使紅耳龜嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞變化明顯，pH 5組嗜中性粒細(xì)胞高于pH 7、pH 6組（P<0.05）；淋巴細(xì)胞低于pH 7、pH 6組（P<0.05）。中華條頸龜白細(xì)胞總數(shù)及各類白細(xì)胞所占比例差異不顯著（P>0.05）。

3 小結(jié)與討論

3.1 孵化基質(zhì)pH對胚胎發(fā)育孵化率、畸形率和孵化期的影響

孵化環(huán)境影響孵化成功率、孵化期和幼體的大小、行為、生長等[14]，pH是影響胚胎發(fā)育重要生態(tài)因子之一[15]。研究表明，隨著孵化環(huán)境pH的降低通常會影響水生動物的胚胎發(fā)育甚至導(dǎo)致畸形和死亡率的增加[15-17]。本試驗(yàn)中隨孵化基質(zhì)pH降低，兩種龜死亡率均呈上升趨勢，pH 4孵化基質(zhì)可使胚胎致死。這與Peterson等[18]對大西洋鮭（Salmo salar）、Allan等[19]對斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)檫^低pH條件下酶的活性受抑制，影響新陳代謝水平，從而影響胚胎發(fā)育，并且過低的pH使卵膜軟化，失去彈性，胎易破膜死亡[20]，而微酸、中性環(huán)境對稚龜孵化率影響較小[21]。

酸脅迫環(huán)境下中華條頸龜稚龜出現(xiàn)畸形，畸形率顯著高于紅耳龜，可能與它們的卵殼結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。中華條頸龜為硬殼卵，通透性強(qiáng)，隨高濃度氫離子濃度的增加，影響胚胎的滲透壓平衡，使新陳代謝水平失調(diào)，造成卵膜某一結(jié)構(gòu)破壞或功能喪失[15]?；蝹€(gè)體在野外生存過程中自然比正常個(gè)體的適應(yīng)性要差，紅耳龜在這一方面是占據(jù)優(yōu)勢的。孵化期方面，紅耳龜孵化期縮短使其比處在同一生態(tài)位的中華條頸龜更早搶奪食物、棲息地等資源。在自然界，孵化期越長，受到敵害和惡劣氣候破壞的機(jī)會越多，縮短孵化期對動物具有重要意義。因而從畸形率、孵化期來說，酸脅迫對中華條頸龜?shù)牟焕绊懘笥诩t耳龜。

3.2 孵化基質(zhì)pH對兩種龜血細(xì)胞形態(tài)的影響

血細(xì)胞是動物機(jī)體對自身生理狀態(tài)變化和對外界環(huán)境因子刺激非常敏感的細(xì)胞，在載氧、機(jī)體免疫和凝血中起著重要的作用[22]。有研究表明，隨pH的減小，紅細(xì)胞吸水膨脹，使其形態(tài)指標(biāo)值逐漸增大[23]。這與pH 7、pH 6、pH 5組紅耳龜紅細(xì)胞長、短徑及二者比逐漸增大的結(jié)果一致。隨著pH降低，紅耳龜紅細(xì)胞數(shù)量增多，中華條頸龜變化不明顯，可能是與酸脅迫環(huán)境有關(guān)。長期以來一直認(rèn)為酸性水體可使魚類血液中的pH下降，使一部分血紅蛋白與氧的結(jié)合受阻，從而減弱其載氧能力[24]。所以，pH的降低有可能會使稚龜胚胎缺氧，使貯藏性紅細(xì)胞釋放[25]，紅細(xì)胞增多是一種獲得缺氧代償能力的表現(xiàn)[26]。另外，紅細(xì)胞尚具有一定的非特異性免疫能力[27]。紅耳龜血紅細(xì)胞的增多是對惡劣環(huán)境的一種應(yīng)激反應(yīng)。

研究表明，機(jī)體可對外界或內(nèi)部的各種異常刺激產(chǎn)生非特異性應(yīng)答反應(yīng)，在酸性環(huán)境下孵化可使兩種胚胎受到刺激，發(fā)生急性或慢性應(yīng)激反應(yīng)[28]。受到急性刺激后，通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（HPA）軸產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素[29]。其中皮質(zhì)酮可通過影響血漿中白細(xì)胞和抗體的數(shù)量而對免疫能力產(chǎn)生影響。當(dāng)急性刺激轉(zhuǎn)變成慢性刺激時(shí)，HPA的負(fù)反饋調(diào)節(jié)則會鈍化甚至失效，慢性應(yīng)激發(fā)生。由此引發(fā)的一系列副反應(yīng)將對機(jī)體產(chǎn)生毒害作用[30]，已有大量試驗(yàn)證明，長期高水平的皮質(zhì)酮可抑制鳥類的繁殖和免疫能力。紅耳龜中嗜中性粒細(xì)胞增加體現(xiàn)了正常的免疫防御機(jī)制。中華條頸龜?shù)陌准?xì)胞數(shù)量隨pH降低而增多，但差異不顯著，正是免疫抑制的體現(xiàn)。由于中華條頸龜經(jīng)歷了由急性應(yīng)激到慢性應(yīng)激的轉(zhuǎn)變，說明了其急性刺激閾值低于紅耳龜，更易受到酸脅迫環(huán)境的不利影響。

由此可見，當(dāng)胚胎發(fā)育過程中面對酸脅迫時(shí)，紅耳龜較低的畸形率和縮短的孵化期特征都是有利于自身生存的，優(yōu)于中華條頸龜，并以具有較高急性刺激閾值的特點(diǎn)，比中華條頸龜較少受到酸脅迫的不利影響，表現(xiàn)為較強(qiáng)的耐受性。

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（責(zé)任編輯 屠 晶）

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（責(zé)任編輯 屠 晶）

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（責(zé)任編輯 屠 晶）