酵母葡聚糖遺傳毒性研究

遠婷+劉遠林+陳希元

摘要：為測試酵母葡聚糖遺傳毒性，為酵母葡聚糖的安全性以及毒性機制提供有益的借鑒，試驗以成年SD大鼠和SPF-KM小鼠為研究對象，以鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames試驗）、骨髓細胞微核試驗和精子畸形試驗綜合評估酵母葡聚糖遺傳毒性。結(jié)果表明，酵母葡聚糖在上述試驗中均表現(xiàn)陰性結(jié)果，均無致突變性，因而沒有呈現(xiàn)出顯著的遺傳毒性。說明酵母葡聚糖對正常狀態(tài)的細胞沒有遺傳毒性作用。在該試驗條件下，可以初步認為在推薦劑量內(nèi)使用酵母葡聚糖是安全可靠的。

關(guān)鍵詞：酵母葡聚糖；遺傳毒性；安全性

中圖分類號：TS201.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0142-04

Study on Genetic Toxicity of Yeast Glucan

YUAN Ting，LIU Yuan-lin，CHEN Xi-yuan

（Zhangjiakou College，Zhangjiakou 075000，Hebei，China）

Abstract： With SD adult rats and SPF-KM mouse as subjects， the genetic toxicity of yeast glucan were evaluated though Ames test， micronucleus test and sperm shape abnormality test. The results showed that the above tests for yeast glucan were all negative and it had no mutagenicity. It indicated that the yeast glucan had no genetic toxicity effect on normal cells. The utilization of yeast glucan were safe and reliable in recommended dose.

Key words： yeast glucan； genetic toxicity； safety

收稿日期：2013-06-19

基金項目：河北省張家口市科技局青年基金項目（zjkkj-2012-067）

作者簡介：遠 婷（1983-），女，河北張家口人，講師，碩士，主要從事生物專業(yè)教學與研究工作，（電話）15830375291（電子信箱）

yuantingting2013@163.com。

酵母葡聚糖為一種多糖，分子呈三重超微螺旋狀，存在于酵母細胞壁中，可以從酵母中提取而來[1]。已有研究表明，酵母葡聚糖能夠激活人體內(nèi)的IgM抗體，發(fā)揮比較顯著的免疫活性，應(yīng)用于人類腫瘤、創(chuàng)傷恢復以及感染病的治療[2]；酵母葡聚糖還能有效改善血脂指數(shù)，降低人類心腦血管和冠心病等疾病的患病率[3，4]；此外，酵母葡聚糖還可以通過激活紅細胞、單核白細胞和粒細胞的生成，抵御輻射源的損害；還能增強人體消化功能[5，6]。近年來，作為一種效果顯著、毒副作用較小的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，酵母葡聚糖已經(jīng)在不少領(lǐng)域（食品、醫(yī)藥及保健品）得到推廣應(yīng)用[7]。當前，中國有關(guān)酵母葡聚糖生產(chǎn)工藝以及抑菌、免疫學的研究取得了不少成果，但有關(guān)其遺傳毒性的研究報道較少。本研究以酵母葡聚糖為受試物，以成年SD大鼠和SPEKM小鼠作為研究對象，以鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames試驗）、骨髓微核試驗以及精子畸形試驗來評價酵母葡聚糖遺傳毒性，旨在為系統(tǒng)研究酵母葡聚糖的安全性及毒性機制提供有益的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

50日齡170 g左右成年SD大鼠及50日齡20 g左右清潔級SPF-KM小鼠，購自河北北方學院醫(yī)學部動物醫(yī)學研究所，正常飼喂，室溫與相對濕度保持正常，并隨時觀察其健康狀況。

1.2 藥物和試劑

小牛血清（Deproteinised calf blood lnjection），購自錦州奧鴻藥業(yè)有限責任公司；注射用環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide），購自上海研晶實業(yè)有限公司；伊紅染色液（Eosin staining solution），購自上海圻明生物科技有限公司；吉姆薩染液及吉姆薩應(yīng)用液（Giemsa stain），購自上海百威靈化工商貿(mào)有限責任公司；酵母葡聚糖（Dextran），購自徐州賽傅生物科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基與菌株

頂層瓊脂培養(yǎng)基、底層瓊脂平板培養(yǎng)基（用于Ames試驗）、普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基（NutrientAgar）。鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102（上海北諾生物科技有限公司）。

1.4 Ames試驗

通過多氯聯(lián)苯誘導法，獲取被試大鼠肝微粒體酶（S-9），與輔助因子（0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液、1.65 mol/L氯化鉀溶液及0.4 mol/L氯化鎂溶液等）配制濃度為10%的S-9混合液作為體外代謝活化系統(tǒng)。

以鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102作為試驗用菌株，分別在加S-9混合液與不加S-9混合液條件下進行平皿摻入試驗，試驗菌株先進行增菌培養(yǎng)，然后與不同劑量的酵母葡聚糖（加或不加S-9混合液）在頂層培養(yǎng)基充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上， 轉(zhuǎn)動平板， 使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后， 倒置于37 ℃培養(yǎng)48 h后，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。結(jié)果判定參照文獻[8]。

試驗設(shè)置5個酵母葡聚糖劑量組，即200、500、1 000、2 500、5 000 μg/皿，每個劑量組均做3個平行平板。同時設(shè)置溶劑對照組（生理鹽水）、空白對照組（自發(fā)回變）以及陽性誘變劑對照組。其中，加S-9混合液的陽性對照組的誘變劑：TA97、TA98及TA100為2-氨基芴，TA102為1，8-二羥基蒽醌；不加S-9混合液的陽性對照組的誘變劑：TA97為瘧的平、TA98為正定霉素，TA100和TA102為甲基磺酸甲酯。

1.5 小鼠骨髓細胞微核試驗

選擇50日齡20 g左右清潔級SPF-KM小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)72 h之后，隨機分5組，每組10 只，雌雄各半。酵母葡聚糖低、中、高劑量處理組分別按1 000、2 500、5 000 mg/kg體重的劑量腹腔注射酵母葡聚糖；陽性對照組以40 mg/kg體重的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺；陰性對照組以蒸餾水分2次灌胃，劑量控制在25 mL/kg體重，每次間隔時間為24 h。在末次給藥后6 h，以頸椎脫臼法處死被試小鼠并解剖，取其胸骨骨髓懸于小牛血清，以常規(guī)方法涂片染色，在油鏡下鏡檢，以有核細胞形態(tài)完好作為微核發(fā)生率計算依據(jù)，計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞（PCE）含微核的PCE數(shù)，并且計數(shù)200個細胞中PCE與RBC（紅細胞）的比值。

1.6 小鼠精子畸形試驗

選擇50日齡20 g左右清潔級SPF-KM小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)72 h之后，隨機分5組，每組10 只，雌雄各半。試驗組：受試小鼠連續(xù) 5 d以不同劑量的酵母葡聚糖（低、中、高劑量組分別為1 000、

2 500、5 000 mg/kg體重）灌胃；陰性對照組：連續(xù)5 d以蒸餾水按20 mL/kg體重灌胃；陽性對照組：連續(xù)5 d以 40 mg/kg體重的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺。在注射或灌注受試藥物后35 d，以頸椎脫臼法處死被試小鼠，剝離其附睪置于裝有1 mL生理鹽水的燒杯中，以眼科剪縱向剪2 刀，吸濾液涂片、固定、染色。光學顯微鏡鏡檢，每只被試小鼠鏡檢1 000 個精子，并計算其畸形率。

1.7 統(tǒng)計學方法

以SPSS統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ames試驗結(jié)果

在試驗過程中，各個劑量組與對照組均可見有背景菌生長，并且未發(fā)生污染。培養(yǎng)基中若存在致突變物，則菌株會表現(xiàn)出野生型回復突變。因此回復突變菌落數(shù)可以表明受試物是否是突變菌落的誘因。不同劑量酵母葡聚糖Ames試驗結(jié)果見表1。由表1可見，無論加還是不加S-9混合液，酵母葡聚糖各劑量組中其回變菌落數(shù)均基本無變化，與溶劑對照組相當，而陽性對照組數(shù)值則遠高于其他組別。文獻表明，受試樣品的回變菌落數(shù)如果增加至溶劑對照回變菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系者，則可判定為具備了統(tǒng)計學意義的陽性反應(yīng)。而表1中受試物各劑量組數(shù)據(jù)與溶劑對照組相比均未出現(xiàn)明顯增長，因此可以判定酵母葡聚糖Ames試驗中不存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明酵母葡聚糖對TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株均無致突變性，沒有呈現(xiàn)出顯著的遺傳毒性。

2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果

小鼠骨髓細胞微核試驗的目的是檢測被試小鼠骨髓細胞染色體畸變情況，如果骨髓細胞遭到有毒物質(zhì)的干擾，會出現(xiàn)微核，染色后微核即可與正常細胞相區(qū)分，從而檢測出微核率，微核率即可作為細胞毒性的主要指標。試驗期內(nèi)，各組試驗動物均未有死亡。不同劑量酵母葡聚糖灌胃后小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果見表2。由表2可見，陽性對照組PCE細胞微核率與陰性對照組相比差異極顯著（P<0.01），而酵母葡聚糖不同劑量組小鼠PCE細胞微核率未發(fā)生明顯變化，均與陰性對照組接近，沒有表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。各組PCE/RBC比值均與陰性對照組接近，表明酵母葡聚糖對各組小鼠均未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。

2.3 小鼠精子畸形試驗結(jié)果

小鼠精子畸形試驗的目標是檢驗酵母葡聚糖的生殖細胞致突變作用。被試精子如果發(fā)生畸變則表明小鼠基因突變。小鼠精子畸形試驗結(jié)果見表3。由表3可知，與陰性對照組比較，酵母葡聚糖各劑量組精子畸形率差異均不顯著。一般來講，小鼠精子的畸形率正常范圍為0.8%～3.5%[9]。由此可判定被試小鼠精子畸形率均在正常范圍內(nèi)，且未受酵母葡聚糖劑量的影響，無劑量-效應(yīng)關(guān)系。

3 小結(jié)與討論

在檢測化學物或藥物等物質(zhì)致突變性的方法中，Ames試驗由于其快速、簡便的優(yōu)勢而使用最多。微核廣泛存在于細胞的主核之外，相關(guān)研究表明，微核為細胞個體由于染色體發(fā)生斷裂而在其有絲分裂階段出現(xiàn)在核外的物質(zhì)，這種物質(zhì)與生物的染色體畸變呈高度相關(guān)[9-11]。PCE細胞指的是細胞個體在最后一次分裂的時候被排出細胞核的還沒有成熟的細胞，這種細胞中有微核的存在，所以在試驗和測試中往往以被試動物的微核率來判定染色體畸變是否顯著，進而以此作為被試物是否對動物個體產(chǎn)生了突變作用的依據(jù)；來自外界的化學物質(zhì)的致突變影響往往首先表現(xiàn)在動物的生殖系統(tǒng)中，哺乳動物的生殖腺對化學毒物的致突變作用反應(yīng)明顯，因此可以把被試動物的精子畸形率作為致突變作用的測量依據(jù)[12，13]。本研究從Ames試驗、骨髓細胞微核試驗、精子畸形試驗幾方面來評價酵母葡聚糖對原核細胞、體細胞、生殖細胞的遺傳毒性。這3項試驗也是《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導原則》的標準試驗[14]。本研究結(jié)果表明，酵母葡聚糖在200、500、1 000、2 500、5 000 μg/皿受試劑量下，無論加不加S-9混合液，各劑量組回變菌落數(shù)均無明顯變化，與溶劑對照組接近，而陽性對照組相應(yīng)數(shù)值則遠高于其他組別，表明酵母葡聚糖在受試濃度下沒有呈現(xiàn)出顯著的遺傳毒性，鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗不存在劑量-效應(yīng)關(guān)系；酵母葡聚糖在1 000、2 500、5 000 mg/kg體重劑量水平下，各組被試動物PCE細胞微核率均無顯著差異，且與陰性對照組接近，沒有明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系，無誘發(fā)骨髓嗜多染紅細胞微核的效應(yīng)；酵母葡聚糖對精子的致畸率均在正常范圍，各劑量組精子畸形率差異均不顯著。綜上所述，在本試驗條件下，可以初步認為在推薦劑量內(nèi)使用酵母葡聚糖是安全可靠的。

參考文獻：

[1] CZERUCKA D， PICHE T， RAMPAL P. Yeast as probiotics-Saccharomyces boulardii[J]. Alimentary Pharmacology and Therapeutics，2007，26（6）：767-778.

[2] CZERUCKA D， RAMPAL P. Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens[J]. Microbes and Infection，2012，4（7）：733-739.

[3] INOUE A， KODAMA N， NANBA H. Effect of maitake （Grifola frondosa） D-fraction on the control of the T lymph node Th-1/Th-2 proportion[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2002，25（4）：536-540.

[4] SUZUKI Y， ADACHI Y， OHNO N， et al. Th1/Th2-Balancing immunomodulating activity of gel-forming（1-3）-beta-glucans from fungi[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2001， 24（7）：811-819.

[5] 嚴而清，孫 偉.谷物中 β-葡聚糖對營養(yǎng)和健康的作用[J].江蘇食品與發(fā)酵，1996（3）：34-36.

[6] 黃國宏，李德科，曾慶孝.酵母 β-1，3葡聚糖研究進展[J].釀酒科技，2006（12）：100-103.

[7] 龍海衣，郭玲玲，張 巍，等.啤酒酵母泥的綜合利用[J].釀酒，2009（6）：86-87.

[8] 中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[S]. 2003.

[9] 楊春梅，艾紅軍，張 躍.聚β-羥基丁酸酯材料的鼠傷寒沙門氏菌回復突變實驗[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（21）：4137-4140.

[10] DOGLI ESPOSTI M A， SMYTH M J. Close encounter of different kinds：dentritic cells and NK cells take center stage[J].Nature Rev Immunol，2005，5（2）：112-124.

[11] WESTIN G， BJORKLUND P，AKERSTROM G. Molecular genetics of parathy-roid disease[J].World J Surg，2009，33（11）：2224-2233.

[12] MRZEK K，HARPER D P，APLAN P D. Cytogenetics andmolecular genetics of acute lymphoblastic leukemia[J].Hematol Oncol Clin North Am，2009，23（5）：991-1010.

[13] 張 靜，熊習昆，楊 穎，等.守宮木致CHL及V79細胞染色體畸變作用[J].中國公共衛(wèi)生，2009，25（3）：327-329.

[14] 袁伯俊，廖明陽，李 波.藥物毒理學實驗方法與技術(shù)[M].北京：化學工業(yè)出版社，2011.

[2] CZERUCKA D， RAMPAL P. Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens[J]. Microbes and Infection，2012，4（7）：733-739.

[3] INOUE A， KODAMA N， NANBA H. Effect of maitake （Grifola frondosa） D-fraction on the control of the T lymph node Th-1/Th-2 proportion[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2002，25（4）：536-540.

[4] SUZUKI Y， ADACHI Y， OHNO N， et al. Th1/Th2-Balancing immunomodulating activity of gel-forming（1-3）-beta-glucans from fungi[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2001， 24（7）：811-819.

[5] 嚴而清，孫 偉.谷物中 β-葡聚糖對營養(yǎng)和健康的作用[J].江蘇食品與發(fā)酵，1996（3）：34-36.

[6] 黃國宏，李德科，曾慶孝.酵母 β-1，3葡聚糖研究進展[J].釀酒科技，2006（12）：100-103.

[7] 龍海衣，郭玲玲，張 巍，等.啤酒酵母泥的綜合利用[J].釀酒，2009（6）：86-87.

[8] 中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[S]. 2003.

[9] 楊春梅，艾紅軍，張 躍.聚β-羥基丁酸酯材料的鼠傷寒沙門氏菌回復突變實驗[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（21）：4137-4140.

[10] DOGLI ESPOSTI M A， SMYTH M J. Close encounter of different kinds：dentritic cells and NK cells take center stage[J].Nature Rev Immunol，2005，5（2）：112-124.

[11] WESTIN G， BJORKLUND P，AKERSTROM G. Molecular genetics of parathy-roid disease[J].World J Surg，2009，33（11）：2224-2233.

[12] MRZEK K，HARPER D P，APLAN P D. Cytogenetics andmolecular genetics of acute lymphoblastic leukemia[J].Hematol Oncol Clin North Am，2009，23（5）：991-1010.

[13] 張 靜，熊習昆，楊 穎，等.守宮木致CHL及V79細胞染色體畸變作用[J].中國公共衛(wèi)生，2009，25（3）：327-329.

[14] 袁伯俊，廖明陽，李 波.藥物毒理學實驗方法與技術(shù)[M].北京：化學工業(yè)出版社，2011.

[2] CZERUCKA D， RAMPAL P. Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens[J]. Microbes and Infection，2012，4（7）：733-739.

[3] INOUE A， KODAMA N， NANBA H. Effect of maitake （Grifola frondosa） D-fraction on the control of the T lymph node Th-1/Th-2 proportion[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2002，25（4）：536-540.

[4] SUZUKI Y， ADACHI Y， OHNO N， et al. Th1/Th2-Balancing immunomodulating activity of gel-forming（1-3）-beta-glucans from fungi[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2001， 24（7）：811-819.

[5] 嚴而清，孫 偉.谷物中 β-葡聚糖對營養(yǎng)和健康的作用[J].江蘇食品與發(fā)酵，1996（3）：34-36.

[6] 黃國宏，李德科，曾慶孝.酵母 β-1，3葡聚糖研究進展[J].釀酒科技，2006（12）：100-103.

[7] 龍海衣，郭玲玲，張 巍，等.啤酒酵母泥的綜合利用[J].釀酒，2009（6）：86-87.

[8] 中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[S]. 2003.

[9] 楊春梅，艾紅軍，張 躍.聚β-羥基丁酸酯材料的鼠傷寒沙門氏菌回復突變實驗[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（21）：4137-4140.

[10] DOGLI ESPOSTI M A， SMYTH M J. Close encounter of different kinds：dentritic cells and NK cells take center stage[J].Nature Rev Immunol，2005，5（2）：112-124.

[11] WESTIN G， BJORKLUND P，AKERSTROM G. Molecular genetics of parathy-roid disease[J].World J Surg，2009，33（11）：2224-2233.

[12] MRZEK K，HARPER D P，APLAN P D. Cytogenetics andmolecular genetics of acute lymphoblastic leukemia[J].Hematol Oncol Clin North Am，2009，23（5）：991-1010.

[13] 張 靜，熊習昆，楊 穎，等.守宮木致CHL及V79細胞染色體畸變作用[J].中國公共衛(wèi)生，2009，25（3）：327-329.

[14] 袁伯俊，廖明陽，李 波.藥物毒理學實驗方法與技術(shù)[M].北京：化學工業(yè)出版社，2011.