運(yùn)用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)原代乳鼠心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)及搏動(dòng)評(píng)價(jià)抗心律失常藥物

王淑顏，汪溪潔，靳 康，惠濤濤，馬 璟

〔1.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203；2.艾森生物(杭州)有限公司，浙江杭州 310030〕

運(yùn)用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)原代乳鼠心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)及搏動(dòng)評(píng)價(jià)抗心律失常藥物

王淑顏1，汪溪潔1，靳 康2，惠濤濤1，馬 璟1

〔1.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203；2.艾森生物(杭州)有限公司，浙江杭州 310030〕

目的 建立實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)(RTCA)心臟毒性研究方法,并應(yīng)用于藥物心臟毒性的早期篩選。方法 采用RTCA Cardio系統(tǒng)和新生1～2 d SD大鼠原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞建立體外藥物心臟毒性早期篩選方法,并用具有抗心律失常藥物奎尼丁和利多卡因,通過觀察心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、幅度和搏動(dòng)節(jié)律不規(guī)則性(BRI)指數(shù)的變化,驗(yàn)證其評(píng)價(jià)藥物的心臟毒性的效果。結(jié)果 原代心肌細(xì)胞接種到RTCA Cardio E-Plate 96孔板24 h后出現(xiàn)心肌細(xì)胞搏動(dòng),48 h后心肌細(xì)胞搏動(dòng)規(guī)律且穩(wěn)定,可持續(xù)至少3 d。加入奎尼丁后迅速抑制心肌細(xì)胞的搏動(dòng),使心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率由155±5降到 0,6 h后抑制作用減弱；低濃度奎尼丁(3.1 μmol·L－1)使心肌細(xì)胞搏動(dòng)恢復(fù)到124±16。24 h奎尼丁濃度小于100.0 μmol·L－1時(shí),均能全部恢復(fù)細(xì)胞搏動(dòng)。利多卡因加入原代心肌細(xì)胞后,心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率、幅度、BRI的變化趨勢(shì)呈明顯的濃度依賴性,濃度越高,對(duì)心肌細(xì)胞的抑制作用越顯著。結(jié)論 RTCA Cardio心臟毒性篩選方法可精確地檢測(cè)出奎尼丁和利多卡因的心臟毒性,提示RTCA Cardio心臟毒性篩選方法可用于心臟毒性早期篩選。

藥物評(píng)價(jià),臨床前；實(shí)時(shí)系統(tǒng)；奎尼?。焕嗫ㄒ?；心臟毒性

實(shí)時(shí)細(xì)胞分析Cardio(real-time cell analysis Cardio，RTCA Cardio)是一種基于電子阻抗的非標(biāo)記、非侵入性、實(shí)時(shí)的細(xì)胞分析監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。于2011年推出，可記錄體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率、幅度、搏動(dòng)節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)(beating rhythm irregularity，BRI)等指標(biāo)?？岫『屠嗫ㄒ蚴桥R床常用且有良效的Ⅰ類抗心律失常藥，但這些藥物均有潛在的致心律失常作用，即引起原有心律失常加重或誘發(fā)新的心率失常[1]。本文首先采用1～2 d SD大鼠心肌細(xì)胞建立RTCA Cardio心臟毒性研究方法，并通過此方法監(jiān)測(cè)抗心律失常藥物奎尼丁和利多卡因?qū)π募〖?xì)胞的生長(zhǎng)、瞬時(shí)及長(zhǎng)時(shí)搏動(dòng)狀態(tài)的影響，為以后藥物心臟毒性早期篩選方法的驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

利多卡因，批號(hào):091M0290V，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；奎尼丁，批號(hào):BCBB6721V，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；明膠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ、PBS和HBSS均購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；乙醇、二甲亞砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生1～2 d SD大鼠10只，SPF級(jí)動(dòng)物，雌雄不限，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SXCK(滬)2008-0016。

1.3 主要儀器設(shè)備

KK24V45 4℃與－20℃冰箱，德國(guó)Siemens公司；WFO-400高壓滅菌鍋，日本Eyela公司；AE100精密天平，美國(guó)Mettler Toledo公司；Thermo 815恒溫培養(yǎng)箱、ST16R臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific公司；生物安全柜，上海瑞仰凈化設(shè)備有限公司；xCELLigence Cardio細(xì)胞功能分析儀，美國(guó)ACEA Biosciences公司。

1.4 乳大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)

取新生1～2 d的SD大鼠，用75%乙醇消毒。在超凈臺(tái)內(nèi)迅速打開胸腔夾取心臟心尖部，置于預(yù)冷的 DMEM中漂洗 3次。將心尖部組織剪成1 mm3碎片，1.5 mL 0.07%胰蛋白酶和0.05%膠原酶Ⅱ消化液37℃恒溫消化12次，棄去上清。向殘留組織塊中加入5 mL含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基吹打3～4次，收集上清800×g離心5 min，棄去上清，用5 mL含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液移至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行差速貼壁2次，每次45 min。

1.5 RTCA Cardio系統(tǒng)基線的測(cè)定及心肌細(xì)胞搏動(dòng)的監(jiān)測(cè)

向RTCA Cardio E-Plate 96孔板每孔中加入50 μL滅菌后0.1%明膠溶液，置于4℃過夜。移去包被液后，加入50 μL培養(yǎng)基，并將其放在RTCA Cardio工作站上測(cè)基線。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞配制成2×109L－1的細(xì)胞懸液。向RTCA E-Plate Cardio 96孔板每孔中加入100 μL細(xì)胞懸液，使孔中細(xì)胞數(shù)量達(dá)到每孔20 000個(gè)，室溫放置30 min后，將其放在RTCA Cardio工作站上監(jiān)測(cè)。每天換液，換液體積120 μL(總體積150 μL)。心肌細(xì)胞對(duì)溫度的變化較為敏感，溫度變化可使心肌細(xì)胞的搏動(dòng)信號(hào)減弱或消失，因此，每次換液都要有部分殘留，且換液過程要快，第2次換液后2 h給藥。用0.1%DMSO作為對(duì)照組，奎尼丁、利多卡因分別設(shè)計(jì)4個(gè)濃度組:即3.1，12.5，50.0和200.0 μmol·L－1及12.5，25.0，50.0和100.0 μmol·L－1，每組4個(gè)復(fù)孔。

1.6 信號(hào)采集

數(shù)據(jù)由RTCA Cardio Software 1.0進(jìn)行控制和采集，數(shù)據(jù)采集設(shè)置如表1。每次測(cè)量時(shí)間為20 s，時(shí)間分辨率為12.9 ms。獲得數(shù)據(jù)后，使用RTCA Cardio Software 1.0對(duì)心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率、幅度、BRI進(jìn)行分析。

Tab.1 Data coIIection setting

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0軟件、RTCA Cardio software 1.0、Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代心肌細(xì)胞在RTCA Cardio系統(tǒng)的生長(zhǎng)狀態(tài)

將分離出的新生1～2 d SD乳鼠的心肌細(xì)胞以每孔2×104個(gè)接種到RTCA E-Plate Cardio 96孔板上，放在培養(yǎng)箱中的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析工作站上培養(yǎng)72 h。由圖1A可知，細(xì)胞指數(shù)(cell index，CI)值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，12 h時(shí)為0.75，24 h時(shí)增加到1.5，42 h輕度下降，由第2次更換培養(yǎng)基引起，44 h恢復(fù)至2.25，之后持續(xù)穩(wěn)定增長(zhǎng)。如圖1B1所示，24 h時(shí)觀察到心肌細(xì)胞特征性的搏動(dòng)圖譜，如圖1B2所示，48 h時(shí)搏動(dòng)圖譜均一、穩(wěn)定，表明心肌細(xì)胞在E-Plate Cardio96孔板上生長(zhǎng)狀態(tài)良好搏動(dòng)穩(wěn)定，如圖1B3所示，72 h時(shí)心肌細(xì)胞的搏動(dòng)信號(hào)減弱。因此，檢測(cè)藥物對(duì)心肌細(xì)胞的作用時(shí)最好在72 h內(nèi)進(jìn)行。

Fig.1 Growth state of primary cardiomyocytes in reaI-time ceII anaIysis(RTCA)Cardio System.A:the growth curve of primary neonatal rat cardiomyocytes at 72 h after plating.n＝4.B:the transient pulse patterns of the myocardial cells were plated after 24 h(B1)，48 h(B2)and 72 h(B3)，respectively.

2.2 RTCA Cardio系統(tǒng)檢測(cè)的奎尼丁對(duì)原代心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、幅度和搏動(dòng)節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)的影響

圖2結(jié)果顯示，高濃度奎尼丁(200.0 μmol·L－1)引起心肌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線CI值24 h內(nèi)顯著性降低；中濃度奎尼丁(50.0和12.5 μmol·L－1)時(shí)CI值12 h內(nèi)顯著性降低；低濃度奎尼丁(3.1 μmol·L－1)時(shí)CI值2 h內(nèi)輕度降低，呈劑量依賴性。給藥前后0.1%DMSO對(duì)照組心肌細(xì)胞特征性搏動(dòng)圖譜未發(fā)生顯著性變化。

圖3結(jié)果顯示，與0.1%DMSO對(duì)照組相比，奎尼丁3.1，12.5，50.0和200.0 μmol·L－1均可抑制心肌細(xì)胞搏動(dòng)，0.5～2 h心肌細(xì)胞特征性搏動(dòng)圖譜為直線，心肌細(xì)胞搏動(dòng)信號(hào)消失(圖3B2，B3，B4；C2，C3，C4；D2，D3，D4；E2，E3，E4)，6 h后抑制作用減弱，低濃度奎尼丁(3.1 μmol·L－1)心肌細(xì)胞特征性搏動(dòng)圖譜逐漸有所恢復(fù)且成一定的劑量-時(shí)間依賴性(圖3B2－B8)，24 h時(shí)(除200.0 μmol·L－1外)心肌細(xì)胞搏動(dòng)基本全部恢復(fù)。

Fig.2 Effect of quinidine on activity of primary neonataI cardiomyocytes.n＝4.

Fig.3 Effect of quinidine on beating of primary neonataI cardiomyocytes.A:0.1%DMSO group；B－E:quinidine 3.1，12.5，50.0 and 200.0 μmol·L－1，respectively.1:0 h time point；2:0.5 h time point；3:1 h time point；4:2 h time point；5:6 h time point；6:12 h time point；7:18 h time point；8:24 h time point.

Fig.4 Effect of quinidine on beat rate(A)，ampIitude (B)and benting rhythm(C)of primary neonataI cardiomyocytes by RTCA Cardio.n＝4.?P＜0.05，compared with 0.1%DMSO.

圖4結(jié)果顯示，0.1%DMSO對(duì)照組心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率、幅度、BRI 3項(xiàng)指標(biāo)在給藥前后未發(fā)生顯著性變化。和0.1%DMSO對(duì)照組相比，奎尼丁(3.1，12.5，50.0和200.0 μmol·L－1)抑制心肌細(xì)胞的上述3項(xiàng)指標(biāo)，呈明顯的濃度依賴性，濃度越高，對(duì)搏動(dòng)頻率、幅度及節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)的抑制作用越顯著，搏動(dòng)信號(hào)恢復(fù)需要的時(shí)間越長(zhǎng)?？岫?00.0 μmol·L－1使心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率、幅度、節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)分別由給藥0 h的151±3，0.029± 0.004和(4±1)%降為給藥0.5 h的0，0，0和24 h心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率、幅度、節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)仍分別為0，0和0，心肌細(xì)胞未能恢復(fù)其搏動(dòng)，由此可知，奎尼丁200.0 μmol·L－1嚴(yán)重?fù)p傷心肌細(xì)胞，具有明顯的細(xì)胞毒性和收縮毒性?？岫?2.5 μmol·L－1使心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、幅度、節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)分別由給藥0 h的156±3，0.031±0.002和(4±1)%降為給藥0.5 h的0，0，0和18 h恢復(fù)到155±8，0.022± 0.004和(141±18)%，此時(shí)心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率、幅度、節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)和對(duì)照組97±5，0.035±0.005和(3±0)%相比，搏動(dòng)幅度明顯降低、搏動(dòng)頻率和節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)顯著升高?？岫?.1 μmol·L－1短時(shí)間內(nèi)(0.5～2 h)抑制心肌細(xì)胞搏動(dòng)，6 h其搏動(dòng)頻率、幅度、節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)分別恢復(fù)到125±16，0.025±0.008和(38±24)%。由此可知，和對(duì)照組相比，奎尼丁對(duì)心肌細(xì)胞具有濃度-時(shí)間依賴性抑制效應(yīng)，且濃度過高時(shí)可嚴(yán)重?fù)p傷心肌細(xì)胞。

2.3 利多卡因?qū)υ募〖?xì)胞的毒性作用

圖5結(jié)果顯示，高濃度利多卡因(100.0 μmol·L－1)和中濃度利多卡因(50.0和25.0 μmol·L－1)作用于心肌細(xì)胞后短時(shí)間內(nèi)(1 h)，和對(duì)照組0.1%DMSO相比生長(zhǎng)曲線CI值明顯下降，且呈濃度依賴性，但隨檢測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)，生長(zhǎng)曲線CI值逐漸恢復(fù)至正常水平，即短時(shí)間內(nèi)中高濃度利多卡因具有明顯的心肌細(xì)胞抑制作用；而低濃度利多卡因(12.5 μmol·L－1)的生長(zhǎng)曲線CI值基本未發(fā)生變化，即長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)未見利多卡因在該測(cè)試濃度范圍內(nèi)有明顯的心肌細(xì)胞抑制作用。

Fig.5 Effect of Iidocaine on activity of primary neonataI cardiomyocytes.n＝4.

圖6結(jié)果顯示，給藥前后0.1%DMSO對(duì)照組心肌細(xì)胞特征性搏動(dòng)圖譜未發(fā)生顯著性變化。和對(duì)照組相比，高濃度利多卡因給藥0.5 h心肌細(xì)胞特征性搏動(dòng)圖譜變?yōu)橹本€，心肌細(xì)胞搏動(dòng)信號(hào)消失，12 h時(shí)心肌細(xì)胞搏動(dòng)逐漸恢復(fù)且在24 h時(shí)觀察到一定的節(jié)律紊亂；中濃度利多卡因給藥0～2 h心肌細(xì)胞特征性搏動(dòng)圖譜為直線，心肌細(xì)胞搏動(dòng)信號(hào)消失，6 h逐漸恢復(fù)，但仍引起搏動(dòng)頻率和幅度的降低，24 h時(shí)觀察到一定的節(jié)律紊亂；低濃度利多卡因給藥24 h內(nèi)，心肌細(xì)胞特征性搏動(dòng)圖譜基本未發(fā)生變化。

Fig.6 Effect of Iidocaine on beating of primary neonataI cardiomyocytes.A:0.1%DMSO group；B，C，D，E: Lidocaine 12.5，25.0，50.0 and 100.0 μmol·L－1，respectively. 1:0 h time point；2:0.5 h time point；3:1 h time point；4:2 h time point；5:6 h time point；6:12 h time point；7:18 h time point；8:24 h time point.

圖7結(jié)果顯示，0.1%DMSO對(duì)照組心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率、幅度、節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)在給藥前后未發(fā)生顯著性變化。和0.1%DMSO對(duì)照組相比，利多卡因可抑制心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率、幅度及節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)，呈明顯的濃度-時(shí)間依賴性，濃度越高，對(duì)搏動(dòng)頻率、幅度及節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)的抑制作用越顯著，搏動(dòng)信號(hào)恢復(fù)需要的時(shí)間越長(zhǎng)且恢復(fù)后節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)越高。高濃度利多卡因(200 μmol·L－1)給藥0 h時(shí)搏動(dòng)頻率、幅度、節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)分別為158±4，0.028±0.006和(4±1)%，給藥0.5 h分別為0，0和 0，給藥 12 h時(shí)分別恢復(fù)到 84±12，0.035±0.012和(80±8)%；中濃度利多卡因(50 μmol·L－1)給藥0 h時(shí)搏動(dòng)頻率、幅度、節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)分別為167±19，0.030±0.008和(4± 1)%，給藥0.5 h分別降為0，0和0，給藥6 h時(shí)分別恢復(fù)到162±65，0.027±0.014和(18±3)%；而低濃度利多卡因(12.5 μmol·L－1)給藥0 h時(shí)搏動(dòng)頻率、幅度、節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)分別為159±4，0.029± 0.005和(4±1)%，給藥 0.5 h分別為 152±21，0.030±0.010和(12±4)%，給藥6 h分別為118±7，0.035±0.009和(4±1)%，給藥12 h分別為92±5，0.017±0.005和(29±7)%，和對(duì)照組相比無顯著性差異。

Fig.7 Effect of Iidocaine on beating rate(A)，ampIitude(B)and beating rhythm irreguIarity(C)of primary neonataI cardiomyocytes by RTCA Cardio.s，n＝4.?P＜0.05，compared with 0.1%DMSO.

3 討論

在本研究中，我們提出了一個(gè)以原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞為基礎(chǔ)，運(yùn)用RTCA Cardio系統(tǒng)監(jiān)測(cè)記錄心肌細(xì)胞生長(zhǎng)和搏動(dòng)狀態(tài)的方法。RTCA Cardio系統(tǒng)具有高的時(shí)間分辨率(12.9 ms)，通過瞬時(shí)和長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)記錄給藥后心肌細(xì)胞搏動(dòng)狀態(tài)變化引起的阻抗信號(hào)的改變對(duì)藥物進(jìn)行評(píng)價(jià)。將心肌細(xì)胞接種到底部含有金屬電極的RTCA Cardio E-Plate 96孔檢測(cè)板上，細(xì)胞與檢測(cè)板底部金屬電極相互作用引起阻抗的變化，阻抗主要是由點(diǎn)及周邊離子環(huán)境所決定[2－3]。當(dāng)心肌收縮和舒張時(shí)引起阻抗變化，將阻抗變化換算成CI值，CI值能反映細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)變化、貼壁程度以及死亡等一系列生理狀態(tài)，通過CI值的變化分析出心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、節(jié)律幅度變化，即在近似生理環(huán)境下實(shí)時(shí)、無標(biāo)記、非侵入性動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、幅度、搏動(dòng)節(jié)律不規(guī)則指數(shù)等指標(biāo)的變化對(duì)藥物進(jìn)行評(píng)價(jià)[4]。這些指標(biāo)既可以評(píng)價(jià)離子通道藥物引起的心肌細(xì)胞生長(zhǎng)和搏動(dòng)狀態(tài)的變化，也可以評(píng)價(jià)非離子通道藥物引起的心肌細(xì)胞生長(zhǎng)和搏動(dòng)狀態(tài)的變化。且該系統(tǒng)可以進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄分析，呈現(xiàn)出心肌細(xì)胞特征性的搏動(dòng)圖譜，這些圖譜的變化可簡(jiǎn)便直觀實(shí)時(shí)觀察到心肌細(xì)胞的搏動(dòng)狀態(tài)，操作相對(duì)簡(jiǎn)單、通量大、靈敏度高。在此實(shí)驗(yàn)中，接種密度為每孔20 000個(gè)，濃度過高或過低均會(huì)影響到心肌細(xì)胞搏動(dòng)的規(guī)律性和穩(wěn)定性。因此，在鋪板時(shí)可以根據(jù)個(gè)人的計(jì)數(shù)習(xí)慣設(shè)置合適的密度。原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞對(duì)溫度變化非常敏感，在換液時(shí)速度要快(7～10 min)，更換培養(yǎng)基時(shí)需部分殘留(1/5)，否則將引起心肌細(xì)胞搏動(dòng)信號(hào)的減弱或消失。

RTCA Cardio系統(tǒng)可以對(duì)影響心臟功能的多靶向藥物作用進(jìn)行整合評(píng)價(jià)，能夠靈敏、定量地檢測(cè)藥物對(duì)參與心肌細(xì)胞生長(zhǎng)和搏動(dòng)功能的主要離子通道的作用，尤其是鈉、鉀、鈣離子通道?？岫∨R床上主要用于治療房顫、房撲的復(fù)律治療及復(fù)律后維持竇律，室上性及室性心動(dòng)過速[5－6]，是一種非選擇性Na＋通道抑制劑，屬于Ⅰa類抗心律失常藥物，可抑制0相、4相Na＋內(nèi)流和3相K＋外流(中度阻斷鈉內(nèi)流，輕度抑制鉀外流)，高濃度奎尼丁可抑制Ca2＋內(nèi)流，降低細(xì)胞的自律性，對(duì)浦肯野細(xì)胞作用最強(qiáng)。通過RTCA Cardio系統(tǒng)監(jiān)測(cè)到在給予奎尼丁(3.1，12.5，50.0和200.0 μmol·L－1)后10 min引起心肌細(xì)胞搏動(dòng)消失，6 h開始逐漸恢復(fù)，18 h后除最高濃度外基本全部恢復(fù)，低濃度奎尼丁(12.5 μmol·L－1)在18～24 h內(nèi)觀察到明顯的心律失常，此觀察結(jié)果與奎尼丁促進(jìn)不良電生理的發(fā)生使房室傳導(dǎo)加快，誘發(fā)室性快速性心律失常的報(bào)道相一致[7－8]。在本次實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的濃度有所偏高，在4個(gè)濃度范圍內(nèi)Ca2＋內(nèi)流被抑制，導(dǎo)致初始階段所有濃度心肌細(xì)胞搏動(dòng)消失，但隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，可呈現(xiàn)一定程度的恢復(fù)，具有一定的濃度依賴性關(guān)系；在作用后期階段(18 h后)，心肌細(xì)胞搏動(dòng)恢復(fù)后搏動(dòng)頻率有較顯著的提高，并且部分濃度會(huì)出現(xiàn)陣發(fā)性快速搏動(dòng)。該作用與藥物臨床上引起心動(dòng)過緩、停博和陣發(fā)性心動(dòng)過速的作用較為接近[9－11]。RTCA Cardio系統(tǒng)整合性地分析評(píng)價(jià)影響心臟功能的藥物對(duì)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)和搏動(dòng)狀態(tài)的影響，從影響心肌細(xì)胞搏動(dòng)狀態(tài)變化的角度去評(píng)價(jià)藥物，有效地降低了單離子通道體外檢測(cè)方法、非離子通道單個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)方法產(chǎn)生的假陰性率。

同樣，利多卡因也是一種Na＋通道抑制劑，同時(shí)還具有K＋通道活化作用[12]，屬于ⅠB類抗心律失常藥，臨床作為終止室速室顫的主要藥物被廣泛應(yīng)用。它通過抑制Na＋電流，抑制心肌細(xì)胞舒張期除極，降低心室肌及心肌傳導(dǎo)纖維的自律性及興奮性。RTCA Cardio系統(tǒng)顯示給予高濃度利多卡因(200.0 μmol·L－1)0.5 h后，迅速引起心肌細(xì)胞搏動(dòng)消失，且在12 h后出現(xiàn)明顯的心率失常。此評(píng)價(jià)結(jié)果與利多卡因引起急性心肌梗死率，缺血再灌注心室壁復(fù)極離散度增加[13]以及誘發(fā)潛在的惡性心律失常的報(bào)道相似[14]。利多卡因抑制Na＋通道的開放，導(dǎo)致心肌細(xì)胞動(dòng)作電位受到抑制，在給藥后短時(shí)間內(nèi)引起心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、幅度降低且呈劑量依賴性。RTCA Cardio系統(tǒng)長(zhǎng)時(shí)間未觀察到利多卡因在測(cè)試濃度范圍內(nèi)明顯的細(xì)胞毒性作用，但高濃度利多卡因(200.0 μmol·L－1)除外，它具有較明顯的心臟毒性作用，且在給藥后12 h產(chǎn)生一定的心律失常，而其他濃度僅有一定的降低搏動(dòng)頻率的作用，說明利多卡因可以降低心肌細(xì)胞的自律性和興奮性，存在一定的濃度依賴性，與Goineau等[15]報(bào)道一致。由此可見RTCA Cardio系統(tǒng)可以通過統(tǒng)計(jì)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、幅度、搏動(dòng)節(jié)律不規(guī)則性的變化，靈敏地、定量地檢測(cè)出藥物對(duì)心肌細(xì)胞的作用。

綜上所述，聯(lián)合利用實(shí)時(shí)RTCA Cardio系統(tǒng)和乳鼠原代心肌細(xì)胞建立的臨床前藥物心臟毒性評(píng)價(jià)方法，可以在早期對(duì)先導(dǎo)化合物的臨床前心臟毒性進(jìn)行篩選，因?yàn)樗臅r(shí)間分辨率，心肌細(xì)胞機(jī)械搏動(dòng)活動(dòng)的動(dòng)態(tài)監(jiān)控，以及96孔板的通量，都將提供非常有價(jià)值的關(guān)于先導(dǎo)化合物對(duì)心臟毒性作用的信息。目前國(guó)外幾個(gè)大型制藥公司已開始使用此技術(shù)進(jìn)行藥物和候選化合物早期的心臟毒性篩選研究。FDA在2012年10月也購(gòu)買了RTCA Cardio系統(tǒng)，說明該方法在制藥領(lǐng)域越來越被認(rèn)可。

[1] Friedman PL，Stevenson WG.Proarrhythmia[J]. Am J Cardiol，1998，82(8A):50N-58N.

[2] Solly K，Wang X，Xu X，Strulovici B，Zheng W. Application of real-time cell electronic sensing(RTCES)technology to cell-based assays[J].Assay Drug Dev Technol，2004，2(4):363-372.

[3] Atienza JM，Yu N，Kirstein SL，Xi B，Wang X，Xu X，et al.Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system [J].Assay Drug Dev Technol，2006，4(5):597-607.

[4] Wang T，Hu N，Cao J，Wu J，Su K，Wang P.A cardiomyocyte-based biosensor for antiarrhythmic drug evaluation by simultaneously monitoring cell growth and beating[J].Biosens Bioelectron，2013，49:9-13.

[5] Osadchii OE.Quinidine elicits proarrhythmic changes in ventricular repolarization and refractoriness in guinea-pig[J].Can J Physiol Pharmacol，2013，91(4):306-315.

[6] Harris K，Aylott M，Cui Y，Louttit JB，McMahon NC，Sridhar A.Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays[J].Toxicol Sci，2013，134(2):412-226.

[7] Li B.22 case oforal quinidine cardioversion of atrial fibrillation[J].Sichuan Med J(四川醫(yī)學(xué))，2003，24(1):101.

[8] Paraskevaidis S，Theofilogiannakos EK，Kamperidis V，Chatzizisis YS，Tsilonis K，Vassilikos VP，et al. Quinidine:an″e(cuò)ndangered species″drug appropriate for management of electrical storm in Brugada syndrome[J].Indian Pacing Electrophysiol J，2013，13(5):178-180.

[9] Zhu JQ，LYU ZR.Arrhythmogenic effect of quinidine and other five kinds of commonly used anti-arrythmic drugs[J].Intermed Med J(中級(jí)醫(yī)刊)，1994，29(3):23-25.

[10] Flaker GC，Blackshear JL，McBride R，Kronmal RA，Halperin JL，Hart RG.Antiarrhythmic drug therapy and cardiac mortality in atrial fibrillation. The Stroke Prevention in Atrial Fibrillation Investigators[J].J Am Coll Cardiol，1992，20(3):527-532.

[11] Wu L，Guo D，Li H，Hackett J，Yan GX，Jiao Z，et al.Role of late sodium current in modulating the proarrhythmic and antiarrhythmic effects of quinidine[J].Heart Rhythm，2008，5(12):1726-1734.

[12] Colatsky TJ.Mechanisms of action of lidocaine and quinidine on action potential duration in rabbit cardiac Purkinje fibers.An effect on steady state sodium currents?[J].Circ Res，1982，50(1): 17-27.

[13] Rea RS，Kane-Gill SL，Rudis MI，Seybert AL，Oyen LJ，Ou NN，et al.Comparing intravenous amiodarone or lidocaine，or both，outcomes for inpatients with pulseless ventricular arrhythmias[J]. Crit Care Med，2006，34(6):1617-1623.

[14] Clancy CE，Wehrens XH.Mutation-specific effects of lidocaine in Brugada syndrome[J].Int J Cardiol，2007，121(3):249-252.

[15] Goineau S，Castagné V，Guillaume P，F(xiàn)roget G. The comparative sensitivity of three in vitro safety pharmacology models for the detection of lidocaine-induced cardiac effects[J].J Pharmacol Toxicol Methods，2012，66(1):52-58.

A reaI-time ceII anaIysis system for evaIuating anti-arrhythmic drugs by monitoring the growth and beating of primary neonataI rat cardiomyocytes

WANG Shu-yan1，WANG Xi-jie1，JIN Kang2，HUI Tao-tao1，MA Jing1
〔1.Shanghai Institute of pharmaceutical Industry，National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation＆Research，State Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai201203，China；2.ACEA BIO(Hangzhou)Co.，LTD，Hangzhou310030，China〕

OBJECTIVE To establish a real-time cell analysis system(RTCA)for early drug cardiotoxicity evaluation.METHODS An in vitro drug cardiotoxicity evaluation method was established using RTCA Cardio system and primary cultured cardiomyocytes of neonatal rats.The beating rate，amplitude and beating rhythm irregularity(BRI)of cardiomyocytes were observered after antiarrhythmic drugs，such as quinidine and lidocaine were added，to assess the effect of the above method on cardiotoxicity evaluation.RESULTS RTCA Cardo E-Plate 96 was inoculated with primary cultured cardiomyocytes that began to beat after 24 h and beat regularly after 48 h.The stable beating was maintained for a minimum of three days.The beating of cardiomyocytes decreased rapidly from 155±5 to 0 after incubation with quinidine.The beating recovered gradually after 6 h.Quinidine at 3.1 μmol·L－1caused the beating rate to return to 124±16.Quinidine allowed the beating rate to return to normal when the concentration was less than 100.0 μmol·L－1.The beating rate，amplitude and BRI of cardiomyocytes changed in a concentration-dependent manner when incubating with lidocaine.The higher the concentration，the more significant the inhibition of lidocaine on cardiomyocytes.CONCLUSION The cardiotoxicity of quinidine and lidocaine can be detected accurately using RTCA Cardio system，suggesting that this system can be used in early evaluation of drug cardiotoxicity.

drug evaluation，preclinical；real-time systems；lidocaine；quinidine；cardiotoxicity

MA Jing，Tel:(021)50801763，E-mail:jma＠ncdser.com

R965.1

:A

:1000-3002(2014)06-0837-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.004

Foundation item:The project supported by National Science and Technology Major Project of China(2012ZX09302002)

2013-11-18 接受日期:2014-08-21)

(本文編輯:喬 虹)

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09302002)

王淑顏，女，碩士研究生，主要研究方向心臟毒理 學(xué)，E-mail:wangshuyan368＠ 163.com，Tel: 13918849591

馬 璟，Tel:(021)50801763，E-mail: jma＠ncdser.com