大鼠發(fā)熱過程中腦腹中膈區(qū)TRPV1及AVPV1受體的表達

曹志友，施蓓，單悅梅，張璠，秦鑫，曹宇

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽110001）

·論著·

大鼠發(fā)熱過程中腦腹中膈區(qū)TRPV1及AVPV1受體的表達

曹志友，施蓓，單悅梅，張璠，秦鑫，曹宇

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽110001）

目的觀察在脂多糖致大鼠發(fā)熱過程中腦腹中膈區(qū)（VSA）瞬時受體電位香草酸受體1（TRPV1）及精氨酸加壓素（AVP）V1受體表達水平的變化。方法實驗動物隨機分為4組：正常對照（N）組、Capsazepine（C）組、脂多糖（L）組和Capsazepine＋脂多糖（C+L）組。連續(xù)觀察體溫變化；對不同實驗條件下VSA中TRPV1的表達采用Western blot方法檢測，AVPV1受體mRNA水平變化采用RT-PCR方法檢測。結(jié)果L組和C+L組體溫顯著增高，C+L組210～510 min期間體溫明顯高于L組（P＜0.01）。TRPV1的表達水平顯示致熱后逐漸增多，L組最高值為基礎(chǔ)狀態(tài)的2.2倍。C+L組為1.72倍。同樣，AVPV1受體mRNA表達水平出現(xiàn)相似的變化趨勢，L組AVPV1受體mRNA表達最大量為基礎(chǔ)狀態(tài)的2.4倍。C+L組為1.95倍。結(jié)論LPS致大鼠發(fā)熱時，體溫升高到一定程度可誘導(dǎo)腹中膈區(qū)TRPV1的表達，并伴有AVPV1受體mRNA表達水平升高，此變化有利于AVP發(fā)揮對體溫的負(fù)調(diào)節(jié)作用。

發(fā)熱；瞬時受體電位香草酸受體1；精氨酸加壓素V1受體；腹中膈

發(fā)熱是機體在致熱原作用下，通過體溫調(diào)節(jié)中樞重調(diào)定產(chǎn)生的病理生理性體溫升高，是機體對致熱原刺激產(chǎn)生的一種調(diào)節(jié)反應(yīng)。目前認(rèn)為發(fā)熱時體溫上升值是由中樞內(nèi)不同調(diào)節(jié)物質(zhì)相互作用的結(jié)果，存在于體溫調(diào)節(jié)中樞的精氨酸加壓素（arginine vasopressin，AVP）是對體溫具有負(fù)調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)，經(jīng)下丘腦分泌后作用于腹中膈區(qū)（ventral septal area，VSA）［1］，然而，關(guān)于中樞調(diào)控發(fā)熱正、負(fù)調(diào)節(jié)物質(zhì)的分子生物學(xué)機制還不清楚。瞬時受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid subfamily member 1，TRPV1）是近年發(fā)現(xiàn)的一種非選擇性陽離子通道蛋白，離體實驗顯示可以直接被43℃以上的較高溫度激活［2］，在體時炎性因子等可降低其激活閾值［3］，激活時通過產(chǎn)生鈣離子內(nèi)向性電流發(fā)揮功能作用［4］。根據(jù)其溫度感受的特性，我們推測存在于體溫調(diào)節(jié)中樞的TRPV1很可能參與發(fā)熱過程的體溫調(diào)節(jié)活動。為進一步探討TRPV1對內(nèi)源性發(fā)熱負(fù)調(diào)節(jié)物質(zhì)AVP作用的調(diào)控，本實驗采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）復(fù)制大鼠發(fā)熱模型，結(jié)合應(yīng)用TRPV1特異性阻斷劑辣椒平（capsazepine），觀察發(fā)熱不同時相VSA組織中TRPV1表達和精氨酸加壓素V1受體（AVPV1 receptor，AVPV1R）表達水平，以期明確TRPV1參與體溫調(diào)節(jié)的中樞機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雄性SD大鼠，96只，體質(zhì)量200～250 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗室溫度控制在（20±2）℃，相對濕度40%～60%，晝夜光照節(jié)律12 h∶12 h，基礎(chǔ)體溫（38.1±0.2）℃，單籠飼養(yǎng)，自由進食水。實驗所用試劑均用無熱原生理鹽水稀釋。

將大鼠隨機均分成4組，每組6只。（1）正常對照組（N組）：腹中膈區(qū)局部注射溶解capsazepine溶劑（簡稱溶劑）10 μL，30 min后腹腔注射生理鹽水（4 mL·kg-1）；（2）Capsazepine組（C組）：腹中膈區(qū)局部注射capsazepine 0.02 mg·kg-1，（美國Sigma公司）配制成溶液10 μL（溶劑為10%無水乙醇+10% Tween80+80%生理鹽水配制），30 min后腹腔注射生理鹽水（4 mL·kg-1）；（3）LPS發(fā)熱組（L組）：向腹中膈區(qū)局部注射溶劑10 μL，30 min后腹腔注射LPS（4 mL·kg-1，LPS濃度為20 μg·ml-1，用生理鹽水配制，美國Sigma公司）；（4）Capsazepine＋LPS組（C+L組）：方法同C組和L組，向腹中膈區(qū)局部注射capsazepine及腹腔注射LPS。L組和C+L組分別取7個采樣時間點。

持續(xù)觀察動物體溫510 min，描繪其體溫變化曲線。檢測樣品采集來自N組和C組于注射生理鹽水后210 min、L組和C+L組分別在給予LPS后0（未施加實驗因素時），30，90，210，270，330，510 min。動物處理采取斷頭，打開顱骨頂，暴露腦組織，按大鼠腦圖譜取出腹中膈區(qū)組織，立即投入液氮中速凍固定，20 min后放入-70℃冰箱內(nèi)待測。

1.2 腹中膈區(qū)插管

將大鼠用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，然后將其頭部固定于立體定位儀上，暴露前囟。參照大鼠腦圖譜，用探針在顱骨表面鉆孔，向腹中膈區(qū)（P：0.8 mm；L：1.5 mm；H：5.4 mm）插入1根不銹鋼管，并留置與之相匹配的針芯，然后用牙科水泥固定。術(shù)后動物單籠飼養(yǎng)，恢復(fù)1周后進行實驗。實驗結(jié)束后檢查插管位置，舍掉位置不正確的實驗數(shù)據(jù)。

1.3 體溫變化曲線的繪制

實驗前對大鼠進行測溫適應(yīng)3 d，進行體溫測量時，將涂有石蠟油的溫度計探頭（北京師范大學(xué)司南儀器廠生產(chǎn)）插入大鼠直腸6 cm處，待數(shù)值穩(wěn)定后讀數(shù)，以給藥前1 h測得的3次直腸溫度的平均值為大鼠基礎(chǔ)體溫。然后各組注射相應(yīng)藥物后30 min記錄1次體溫，直到實驗結(jié)束，測算出體溫變化值（ΔT℃），繪制體溫變化曲線。

1.4 Western blot方法檢測腹中膈組織TRPV1表達

取大鼠腹中膈區(qū)組織，冰浴勻漿，4℃離心（12 000 r·min-1）30 min 2次，取上清。進行蛋白定量后，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加抗TRPV1抗體（1∶1 000）（美國Sigma公司），二抗為羊抗兔IgG（武漢博士德公司產(chǎn)品），ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，圖像分析系統(tǒng)分析。對照選用抗β-肌動蛋白抗體（β-actin）。采用目的蛋白與相應(yīng)β-actin蛋白的灰度比值表示相對表達量。

1.5 RT-PCR檢測

按照Trizol說明書的方法提取腹中膈區(qū)組織RNA。取1 μg按RT-PCR試劑盒檢測方法進行目的基因（AVPV1R）和內(nèi)參基因（β-actin）的擴增。反應(yīng)條件為94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。AVPV1R上游引物為5′-CGACACAGCAAGGGTG ACAAGG-3′，下游引物為5′-AGGAAGCCAGCA ACGCCG-3′，擴增片段的長度為265 bp［5］。β-actin上游引物為5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物為5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴增片段的長度為432 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行mRNA表達水平分析，以AVPV1R/β-actin的灰度比值作為相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗數(shù)據(jù)均用表示，各組間比較應(yīng)用t檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組大鼠體溫變化

如圖1所示，C組與N組比較各時間點的體溫變化值無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。大鼠給予LPS后（L組）可見體溫明顯升高，在210 min時達高峰值，升高（1.33±0.23）℃，在510 min回降至接近基礎(chǔ)水平。L組與N組比較，在90～450 min期間各時間點差異顯著（P＜0.05）。C+L組與N組比較，在90～510 min期間體溫變化值顯著增大（P＜0.01），最高值出現(xiàn)在270 min，為（1.50±0.23）℃。與L組比較，C+L組發(fā)熱時程延長，發(fā)熱幅值升高，在270～510 min期間差異顯著（P＜0.01）。

2.2 VSA組織TRPV1表達的變化

圖1 連續(xù)記錄的各組大鼠體溫變化曲線Fig.1 Body temperature changes in each group rats by continuous recording

圖2顯示了1例在L組（210 min）VSA組織檢測出的TRPV1mRNA和蛋白水平的表達及組織免疫熒光檢測結(jié)果。經(jīng)RT-PCR擴增通過瓊脂糖凝膠電泳可見存在陽性表達產(chǎn)物，其擴增片段長度與設(shè)計產(chǎn)物長度一致。同時也檢測到蛋白質(zhì)陽性表達產(chǎn)物。

圖2 大鼠腹中膈區(qū)TRPV1表達的鑒定Fig.2 Identification of TRPV1 expression in rat ventral septal area

采用Western blot方法檢測的各實驗組在不同時間點VSA組織中TRPV1的表達（圖3），可見L組和C+L組TRPV1表達水平均隨溫度升高而增多，在體溫處于高峰值時（210，270 min）TRPV1表達達到最大量，之后逐漸降低。其中，L組TRPV1表達最大量為基礎(chǔ)狀態(tài)的2.2倍。C+L組為1.72倍。在90，210 min時間點C+L組TRPV1表達顯著低于L組（P＜0.05）。

2.3 VSA中AVPV1RmRNA表達水平變化

采用RT-PCR方法檢測的各實驗組不同時間點VSA組織中AVPV1RmRNA水平的表達，結(jié)果見圖4。N組、C組、L組（0，30，510 min）和C+L組（0，30， 510 min）之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。L組和C+L組隨體溫升高AVPV1RmRNA表達量增多，在體溫明顯升高（90～330 min）時，與N組、C組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），在L組AVPV1RmRNA表達最大量為基礎(chǔ)狀態(tài)的2.4倍。C+L組為1.95倍。C+L組在90，210 min檢測結(jié)果顯著低于L組（P＜0.05）。

3 討論

對于人和其他的恒溫動物，體溫過高會影響機體進行正常的功能活動，甚至造成蛋白質(zhì)變性等不可逆性的損傷［5］。關(guān)于發(fā)熱機制的研究目前主要發(fā)現(xiàn)一些具有抑熱作用的內(nèi)源性物質(zhì)，其中在腦中的AVP作為一種主要的內(nèi)源性解熱物質(zhì)，在機體發(fā)熱過程中具有限制體溫升高的作用，主要通過作用于VSA的V1受體發(fā)揮解熱或限熱作用［6］，然而，機體是如何調(diào)控AVP發(fā)揮這一生理功能目前還不清楚。

圖3 大鼠經(jīng)LPS致熱過程中VSA TRPV1的表達Fig.3 Expression of TRPV1 in VSA in different groups

圖4 LPS致熱大鼠時VSA中AVPV1R mRNA的表達Fig.4 Expression of AVPV1R mRNA in VSA in different groups

TRPV1是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于細胞膜或胞內(nèi)細胞器膜上的一類與多種感受功能有關(guān)的非選擇性陽離子通道蛋白，可以被熱刺激等多種理化因素激活，有關(guān)TRPV1結(jié)構(gòu)及活性的調(diào)控也有了新的研究進展［7］，其基本結(jié)構(gòu)中具有6個跨膜區(qū)，在第五和第六跨膜區(qū)內(nèi)，有一個附加的疏水片段為其核心區(qū)域，在膜內(nèi)N端和C端形成多個結(jié)構(gòu)域。其功能活性主要在轉(zhuǎn)錄后水平通過磷酸化、去磷酸化及糖基化等形式進行調(diào)節(jié)，激活時主要引起Ca2+的大量內(nèi)流，以胞內(nèi)Ca2+濃度增高的形式調(diào)節(jié)著相應(yīng)的生理功能或病理機制的發(fā)生。有研究顯示抑制TRPV1可誘發(fā)出現(xiàn)高體溫［8］，提示TRPV1具有限制體溫升高的作用，特別是存在于體溫調(diào)節(jié)中樞的TRPV1在機體的發(fā)熱反應(yīng)中具有重要的作用。VSA作為神經(jīng)垂體激素主要具有抗利尿作用和收縮血管的作用，是機體重要的應(yīng)激反應(yīng)激素，而作為中樞神經(jīng)遞質(zhì)，除參與學(xué)習(xí)與記憶及行為活動的調(diào)節(jié)以外［9］，如上所述，AVP還是體內(nèi)重要的發(fā)熱負(fù)調(diào)節(jié)物質(zhì)，VSA則是AVP發(fā)揮發(fā)熱負(fù)調(diào)節(jié)作用的靶組織。那么，VSA的AVP受體表達水平很可能是一個重要的調(diào)節(jié)靶點。TRPV1是否通過調(diào)節(jié)AVP受體表達水平，進而影響AVP發(fā)揮抑制發(fā)熱反應(yīng)的作用，這是我們想要明確的問題，為此，我們復(fù)制了LPS發(fā)熱大鼠模型，結(jié)合應(yīng)用TRPV1的阻斷劑（capsazepine），在連續(xù)監(jiān)測體溫變化的同時，檢測了VAS的TRPV1及AVPV1RmRNA的表達水平。Capsazepine是TRPV1的特異性阻斷劑，能抑制TRPV1通道的開放及下調(diào)其表達水平，減少鈣離子內(nèi)流［10］。實驗結(jié)果顯示，在LPS致發(fā)熱過程中，VSA中TRPV1的表達在體溫升高過程中逐漸增多，同時檢測到與之伴隨的AVPV1RmRNA表達水平升高。而預(yù)先腦室內(nèi)給予capsazepine，TRPV1表達量在發(fā)熱達高峰期間低于單純應(yīng)用LPS誘導(dǎo)發(fā)熱組，同樣，AVPV1RmRNA表達水平也出現(xiàn)了相似的變化趨勢。以上結(jié)果說明VSA中的TRPV1表達與AVPV1R的表達相關(guān)聯(lián)，可能在機體發(fā)熱時TRPV1由于具有溫度感受特性而被激活，進而，使AVPV1R的表達量增多，以有利于AVP發(fā)揮限制體溫升高的作用，這可能是TRPV1參與機體發(fā)熱反應(yīng)調(diào)控的重要機制之一，當(dāng)然，有關(guān)更直接的證據(jù)還需要電生理學(xué)等方面的深入研究。

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（編輯 武玉欣）

Expression ofTRPV1 and AVPV1 Receptorsin the VentralSeptalArea ofRatduring Fever

CAOZhi-you，SHIBei，SHANYue-mei，ZHANGFan，QINXin，CAOYu
（DepartmentofPhysiology，College ofBasic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo evaluate of expression levels of transient receptor potential vanilloid receptor 1（TRPV1）and arginine vasopressin（AVP）V1 receptorsin the ventralseptalarea（VSA）ofratduring fever.MethodsThe male rats were randomly divided into fourgroups：the control group（N），the Capsazepine group（CPZ），the LPS group（L）and the Capsazepine+LPS group（CPZ+LPS）.Body temperature of the rats were continuously observed.TRPV1 expression was detected by Western blot andAVPV1mRNA lever was determined by RT-PCR in the VSA.ResultsThe body temperature ofthe rats were increased in both L group and C+L group；the body temperature was significantly higherin C+Lgroup than that in L group during 210-510 min（P＜0.01）.The levelofTRPV1 expression was gradually increased afterthe administration of LPS.The highestvalue in the L group was 2.2 times than that of the basal state，and in the C+L group the value was 1.72 times.Meanwhile，the mRNA level of AVPV1 appeared the similar trend.The maximum expression ofAVPV1mRNA level in group L was 2.4 times than that of the basal state，and the value was 1.95 times in the C+L group.ConclusionDuring the LPS-induced fever，whenever the temperature was rose to a certain degree，the TRPV1 expression could be induced in the VSA and theAVPV1mRNAlevelcould also be increased，which may play a negative effecton the regulation ofthe body temperature.

fever；transient receptor potential vanilloid receptor1；arginine vasopressin；ventral septal area

R332

A

0258-4646（2014）11-0965-04

國家自然科學(xué)基金主任基金（31340074）；遼寧省自然科學(xué)基金（201202277）

曹志友（1981-），男，碩士研究生.

曹宇，E-mail：caoycmu@163.com

2014-08-21

網(wǎng)絡(luò)出版時間：